この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエの成足の解剖方法を実証することです。この技術は、キューティクルの一部を除去し、ニューロンおよび筋肉アーキテクチャを維持する方法で下層組織を露出させる。この手順は、標準的な免疫細胞化学技術を使用して、同定された運動ニューロンアーバーの神経筋接合部を特徴付けることを可能にする。
この解剖は、比較的長期間にわたって起こる遅い変性変化の研究に特に有用である。ショウジョウバエの神経筋接合が変態の発症前に約5〜7日間安定しているため、時間の側面は重要な考慮事項である。逆に、成人ニューロンは、野生型の実験室で飼育されたショウジョウバエメラノガスターのために約90日間、成人ハエの生涯を通じて存在する。
この技術は柔軟であり、さまざまな疾患モデルの遺伝子型の範囲に適用することができ、モデルとしてショウジョウバエに利用可能な抗体の範囲を利用します。この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエの成足の解剖方法を実証することです。この技術は、神経および筋肉のアーキテクチャを維持する方法で下層組織を露出、キューティクルの一部を除去します。
ペイントブラシを使用して、グラスウェルで冷たいメタノールにハエを移すか、約30秒から1分間皿に入れます。メタノールは、カチカール炭化水素を可溶化し、ハエは水溶液に浮かばすのではなく、水没させることができるようになりました。鉗子で、慎重にPBSにハエを移す。
氷冷PBSで3回リンスして余分なメタノールを取り除き、解剖と固定するまで氷の上でハエを保ちます。この時点で、ハエは、可能な限り最短時間、好ましくは30分未満で解剖し、固定する必要があります。冷たいPBSで満たされたシリコーンエラストマー解剖皿にハエを移す。
5番デュモン鉗子の2組を使用してコクサのメタソシック脚を取り除くか、ヴァンナスハサミで脚を切断します。PBSの1ミルで満たされたプラスチック、24ウェルプレートの井戸に脚を移し、すべての脚が取り除かれ、井戸に移されるまで氷の上にプレートを保ちます。私たちは通常、井戸あたり20本の脚を使用します。
PBS溶液を1ミリリットルFA溶液に交換し、ヌテターで30分間回転させます。この設定は中速度で設定します。この間、脚が溶液に完全に沈み込まっていることを確認します。
FA溶液を除去するには、1ミルPBSで3回速く洗浄し、続いて1ミルPBSで5分間さらに3回洗浄します。解剖ステップの前および最中に氷の上に1ミルPBSで組織を保持します。ショウジョウバエの脚の解剖学の簡単な概要を提供するために、脚のセグメントは、コクサ、トロシャンター、大腿骨、脛骨、および5つのタールサルセグメントを含む示されています。
ここでは、後部側に存在する裸のキューティクルとは対照的に、感覚的な毛の存在によって認識される脚の前視を見る。近位遠位軸と側側腹側軸の向きも示されます。この解剖手順は、近位大腿骨から小さなキューティクルを取り除き、脛骨浮上筋を内面的に突き出して突出する軸索樹車を研究することができる。
私たちの前の研究は、推定神経芽細胞の眼系に由来する示されたアーバーに焦点を当てています。この手順では、大腿骨の前側からキューティクルを取り除きます。解剖鉗子は成功にとって非常に重要であり、5番の超微細な鉗子の終わりにわずかな曲げを導入することは、キューティクルを突くのではなく表面的につかむことができるベベルを提供し、組織を台無しにする可能性があることを発見しました。
解剖のためにPBSのシリコーンエラストマー皿に足を移す。1 組の鉗子を使用して、右側に示すように、脛端セグメントをシリコーン エラストマー皿に固定します。ベベル側を下に保持した他の鉗子を使用して、大腿骨の遠位端にキューティクルの一部をつかみ、トロシャンターに向かって近位方向に引っ張ります。
裸の筋肉が大腿骨の近位端全体に見えるまで、系統的にキューティクルを取り除き続けます。すべての脚が解剖されたら、PBSをFA溶液に置き換えて、中速でヌテーターで振って30分間脚を後置します。その後、1ミルPBSでサンプルを3倍速く洗浄し、PBT溶液でそれぞれ5分間3回洗浄します。
組織をブロックするには、1ミルPBTを、PBTで希釈した1ミル5%正常ヤギ血清からなるブロッキング溶液に置き換えます。解剖した脚を室温で4時間、または摂氏4度で一晩インキュベートする。ブロッキング溶液を除去し、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体と交換してください。
ここでは、1~200希釈で大きなアンチディスクを使用しています。プレートをシェーカーに戻し、一晩で4度でインキュベートします。一次抗体インキュベーションに続いて、1ミルPBTで一次抗体を3回短時間洗い、次いでそれぞれ15分間3回洗浄します。
1ミル5%の正常なヤギ血清で、室温で少なくとも2時間、または摂氏4度で一晩ブロックする。ブロッキング溶液を除去し、適切な希釈蛍光共役二次抗体の300マイクロリットルを添加します。さらに、1〜2000の蛍光結合ファロイジンの標識筋肉に1を追加します。
インキュベートするには、実験室のシーリングテープと蓋でウェルを密封します。また、光からフッ素を保護するために、アルミ箔でプレートをラップします。室温で6〜8時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。
非結合二次抗体を除去するために、一次抗体を洗浄する際に先に述べた同様の方法でPBTで洗浄を行う。このステップの後、サンプルをマウントしてイメージ化する準備が整いました。脚の前側を上に並べ、必要に応じて追加の取り付けメディアで覆います。
カバースリップの角を粘土ボールにそっと削ります。得られた粘土は、組織が破砕しないように、スライドとカバースリップの間のスペーサーとして機能します。脚の上部に触れるまでカバースリップを押し下げます。
マニキュアで縁を密封し、イメージングまで4度で保管します。書き込みプロトコルの第4項に記載された画像化パラメータを用いた共焦点顕微鏡による画像。解剖プロトコルの検証に役立つ、我々は低倍率で位相対顕微鏡で脚を最初に画像化します。
左の良好な解剖のパネルAの例と、筋線維が破壊された右側の悪い解剖を次に示します。パネルCは、筋肉が破壊されていない良好な解剖の共焦点像を示す。対照的に、パネルDは、矢印で示されるように、筋線維が欠けている解剖中に損傷した脚を示しています。
ここでは、緑色の抗ディスクが大きい、赤で示されるポストナプティックグルタミン受容体クラスタリングを促進する、青で示す筋肉を標識する、神経プロセスを検出するために、抗西洋ワサビペルオキシダーゼを有する画像化された脚を染色した。透過光路で20倍倍で捕獲すると、解剖された領域を見やすい。なお、抗体は部分的に解剖されていない領域に浸透し、白い矢印で示されるようにキューティクルを通して見ることができる。
脚の運動ニューロンのそれぞれは、筋肉を内面化するときにステレオタイプの投影を行います。私たちの研究は、脛辺浮動筋を内面する運動ニューロンに焦点を当てています, 箱入り領域としてここに示され、白い矢印によって示されています.右上に2倍ズームを持つ高い倍率60倍では、緑色で示されたブトンと赤で示された周囲のDLGを効果的に画像化することができます。
さらにズームを大きくするか、100Xの目標に踏み込むと、右下に示すように、ブートンサイズと形態の定量化が可能になります。この解剖技術と免疫細胞化学を組み合わせることで、ALSのsod1変異モデルにH依存性のブートン腫脹があることを発見し、ここでは、老齢H71Y脚に示され、矢印で示される野生型制御と比較した。ブトンサイズは、右のビーの群れプロットで定量化されます。
さらに、H71Y変異体の緑色で示される弱く染色されたHRP軸索内で、赤で示されるアクティブゾーンマーカーBruchpilotの減少を発見した。神経変性を研究するために、ユビキチン化タンパク質凝集体は抗体FK2によってしばしば検出され、FK2陽性のパンクタとしてここに示され、老化したソッドH71の軸索および筋肉は右手側に飛び、矢印で示される。最後に、ミトコンドリアは、脛骨浮上筋内の赤でここに示すように、抗ATP5aモノクローナル抗体を用いた免疫細胞化学によって可視化することができる。
ミトコンドリアは、H71Y変異体において年齢とともに拡大することがわかった。一度習得すると、解剖された脚の準備および関連する抗体染色は、さまざまな時点であなたの好みの突然変異体のための大人の神経筋接合部での分子変化を分析することを可能にする。
