我々は、この原稿についての有益なコ​​メントのために博士Nael Alamiと博士ナムチョルキムに感謝。

1。免疫蛍光のための準備： <ol><li>解剖表面を作成するには、小規模な組織培養プレートにSylgard 184シリコーンエラストマーベースを注ぐ。解剖領域がリムよりも低くなるように完全にプレートを埋めるためではないことを確認してください。 </li><li>操作の増加を容易にするために約3.5mmの長さに解剖ピンを取り除いて、幼虫ごとに少なくとも6ピンを持っていることを確認してください。 </li><li>あなたは、解剖用のピンを把握できるようになります鈍鉗子が必要になります。 </li></ol> 2。幼虫の解剖： <ol><li>バイアルの側面周囲にクロールされており、蛹になるために開始されていない放浪三齢幼虫を選択してください。 </li><li>実体顕微鏡下で解剖の表面に幼虫を置きます。離れてキムワイプを使用して余分な湿り気を放出する。 </li><li>背側が上を向くようにそれぞれの幼虫を手配する。あなたは、幼虫の背側に沿って2つの気管、白い線を見ることができます。これは背側正中線をマークするため、可能な限り中央にあるセンターこれらをしてみてください。 </li><li>ちょうど口のフックに場所のピン＃1（図1）。 </li><li> ＃2はちょうど気管との間の気門の上に尾部にピンを置きます。 </li><li>キューティクルの乾燥を防ぐために幼虫に少量のPBSを追加。 </li><li>遺伝子型は各遺伝子型間にピンを配置することにより、空間的に離れていることを確認しながら、すべての幼虫で、上記の手順を繰り返します。 </li><li>右のピンの上に小さな横カットの両方気管間＃2（図1）してください。 </li><li>過去のピンまでの気管の間に背側正中線に沿って最初のカットとカットのすべての方法＃1であなたのはさみを挿入します。 </li><li>あなたは左と右サイドは、キューティクルを引っ張ることなく、それらを突き止めることができるように開放されるように、キューティクルの各側面の非常に上部と下部に他の小さな切り傷を作る必要があるでしょう。 </li><li>場所ピン＃の3、4、5、および各コーナーで6。 </li><li>室温で20-25分のために4％PFAでサンプルを修正</li><li> PFAをデカントし、毎回デカント、PBSで3〜4回すすいでください。 </li></ol> 3。組織の除去： <ol><li>通常、脳が配置されている領域を保護するため後端で組織を除去することによって開始します。 </li><li> steromicroscopeとPBSのドロップの下で幼虫とを使用している間、最初に気管の一つの後端をつかみ、それと脂肪体の一部を削除可能性がある、それを引き出します。第二気管について、この手順を繰り返します。 </li><li>後部脂肪体や腸の一部を取得し、準備から外せない。後部組織のほとんどが削除されると、脳の周囲の小さな組織を取り除くことに焦点を当てる。あなたは筋肉、またはNMJの形態にのみ興味があればあなたも脳を削除することができます。 </li><li>脳の除去は、腹部のセグメントの方向に役立つマーカーである筋肉月31日のよりよい視覚化することができます。 </li></ol> 4。アクティブなゾーンのための免疫蛍光： <ol><li>解剖皿の解剖プレップにブロッキング剤（PBS中の5％正常ヤギ血清）を追加します。室温で1時間ブロックします。あなたが唯一のブロッキングと抗体希釈用つのソリューションを可能にすることを希望する場合、0.1％TritonX - 100組織の透過性については、ブロッキング剤に含まれています。 </li><li> 0.1％TritonX - 100でのブロッキング試薬で希釈した一次抗体を適用します。アクティブなゾーンの抗体は、発達研究ハイブリドーマバンク（DSHB、http://dshb.biology.uiowa.edu/）によって達成可能である。 NMJ膜と軸索にラベルを付ける（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ- Cy3の共役）参照抗体を使用してください。 </li><li> 4℃で一晩一次抗体をインキュベートする。冷蔵庫の乾燥度は抗体溶液を蒸発しないように、使用されるピペットチップボックスの一番下にある水を入れて湿度のチャンバーを作成します。漂白蛍光を減らすためにアルミホイルで半透明のふたをカバー。湿度チャンバ内の解剖のスライドを置き、一晩4℃インキュベーターで全体のボックスを置く。 </li><li>翌朝、PBST（0.2％トリトン- X - 100を含むPBS）で5〜10分ごとに5〜10倍で洗ってください。 </li><li>対象となる湿度のチャンバー内で2〜4時間室温で0.1％TritonX - 100でのブロッキング試薬で希釈した二次抗体（例えばインビトロジェンAlexaのヤギ抗マウス- 488）でインキュベートする。あなたが筋肉や脳内の核の位置を特定したい場合は、二次的に（例えば、DAPI）染色核が含まれています。 </li><li> PBST（0.02％のTriton - X - 100を含むPBS）で5-10分ごとに5-10回洗浄する。 </li></ol> 5。スライド上の幼虫のサンプルをマウントする： <ol><li>最後のPBSTで洗浄をデカントし、オフウィク。 </li><li>ピンダウン幼虫の毛皮をカバーするためにピペットで約1mLの80％グリセロール。 </li><li>すべての幼虫の6ピンの5を取り外します。 </li><li>あなたは、スライドの最初の遺伝子型を置くことgenotyのすべての幼虫の最後のピンを削除する準備ができたら、PE。 </li><li>洗浄したスライド上にマウントするメディアの2滴を入れて&quot;洗浄&quot;のスライドを準備。このステップでは、マウントと明確なイメージングのための幼虫オフ水溶液を洗浄することが重要です。 </li><li>あなたの鈍ピンセットで尾して、1つの幼虫をつかむ、グリセロールの大部分を削除するには、周りのグリセロールにして、解剖皿の乾燥したエッジに沿って幼虫をドラッグします。第一封入剤のドロップで幼虫を置きます。 </li><li>同じ遺伝子型の幼虫のすべてについて、ステップ6を繰り返します。 </li><li>一度、すべての幼虫は、最初の封入剤のドロップで、尾による最初の幼虫を取得し、媒体の大部分を除去するために皿の乾燥したエッジに沿って、ドロップとを介してプルです。その後、2つめの固定培地のドロップに幼虫を置く。 </li><li>同じ遺伝子型を持つすべての幼虫のための手順8を繰り返します。 </li><li>それをラベリングし、スライド上にマウントするメディアの小さな&quot;T&quot;の形を置くことによってあなたの最終的なスライドを準備します。 </li><li>ステップ5.8のように、尾部で幼虫をつかみ、2つめの固定培地のドロップで、その後、&quot;ウォッシュ&quot;スライドの乾燥したの側面に沿って毛皮を引き出します。メディアの大多数が脱落した後、封入剤の最後のスライドに幼虫の毛皮を置きます。 </li><li>すべての幼虫の毛皮のために繰り返します。 </li><li>すべての幼虫の毛皮がようにキューティクルの側がダウンしていると暴露した筋肉が上を向いていることを確認して、目的の配置されていることを確認してください。 </li><li> &quot;T.&quot;の上のラインの開始エッジで、解剖幼虫をカバーするためにスライド上にカバースリップを置き、 </li><li>封入剤は、カバースリップの下に完全に広がることを確認し、カバースリップ上の小さな量（例えば9ボルト電池を）置く。 </li><li>封入剤が硬化するまで、可能な蛍光消光を減らすために、引き出しや暗い空間でスライドを配置。 </li><li>カバースリップの研がをオーバーフローマウンティング培地をクリーンアップします。 70％エタノールでカバースリップまたはスライド上の過剰な乾燥した封入剤を拭き取ります。 </li><li>最終的なシールを作成するには、指の爪磨きで封印。 </li></ol> 6。代表的な結果： 解剖と免疫染色幼虫の例のスライドを図2に示されています。幼虫の解剖、汚れ、および取り付けが適切に行われている場合、ユーザーはセグメントA2 - A6に関心の幼虫の筋肉（図3）を識別することができます。ホアンらは詳細な筋肉の位置の説明だけでなく、特定のシナプスboutons（ホアン、千葉、2001）の特性を提供します。ハイパワーの目標を使用してユーザーが単一のシナプスに注目し、Zスタック画像を取ることができます。シナプス6月7日の部分の代表的な最大値投影画像（図4）示されています。イメージングソフトウェアを使用し、アクティブなゾーンを定量的にあなたの突然変異の表現型に特有の特性を評価することができます。特定の突然変異の表現型に変更される可能性のある機能の例としては、総数、flourescence強度、およびアクティブなゾーン間の間隔が含まれています。 潜在的な落とし穴： 幼虫神経筋接合部の免疫蛍光の評価は、このシステムの有用性を制限することができる潜在的な落とし穴があるが、シナプス生物学に貴重な洞察を提供することができる貴重なシステムです。例えば、頻繁にそれは、同じサンプルで複数の一次抗体の染色パターン画像に望ましい。適切な一次抗体、適切な蛍光物質、および適切な陰性対照の選択は、成功に不可欠です。 あなたの実験でイメージング二つの抗原の場合、一次抗体は、目的の各蛋白質が一意に蛍光標識二次抗体で識別できるように、異なる種に由来していることを確認して。バックグラウンドを低減するための推奨方法は、二次抗体（ヤギ抗ウサギまたは抗マウス二次抗体を用いてブロッキング剤として、例えば使用する正常ヤギ血清）の派生元である種の正常血清を含むブロッキング剤を使用することです。 あなたが実験に使用する一次および二次抗体を計画した後、また、あなたの染色のコントロールを含め検討する必要がありますすることで、見ている蛍光シグナルは本物だけでなく、バ​​ックグラウンドであることを保証するために設定します。可能であれば、目的のタンパク質が含まれていないネガティブコントロールサンプルが含まれています。これは簡単に野生型の動物を含めることにより、外因性遺伝子の過剰発現の研究​​で行われているが、いくつかのケースでは目的タンパク質のホモ接合変異体を使用することで実現できます。別の本質的なネガティブコントロール、あなたの蛍光シグナルのバックグラウンドレベルの測定に有用な、主を含むことなく、二次抗体を使用することです。するときには、イメージングして、その結果プレップ、それをあなたが見ていることを蛍光シグナルのすべてが本物ではないかもしれないことを理解しておくことが重要である、とよからの背景かもしれないUR二次抗体または内因性の組織の背景から。あなたは、蛍光強度の間の変更をアッセイする際にバックグラウンドの蛍光を考慮して画像を正規化する必要がある場合があります。 蛍光体の選択は慎重に行う必要があります。それぞれの蛍光体と一意に各信号を検出する能力のための励起および発光スペクトルの考慮はを通じてチャンネルの出血を避けるために不可欠です。不確実性、裏写りの程度一度に1つのフルオロフォア標識抗体と免疫染色、あなたの最後の実験で使用することを各チャネルを持つイメージを確認するかどうかを判断する簡単な方法がある場合。経由でブリードがあなたの顕微鏡フィルターセットで発生している場合、これは明らかにする必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：キューティクルカットし、端子1-6の配置のフローチャートは、 <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/2676/2676fig1_large.jpg">より大きな画像を表示するにはここをクリック</a> <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。最後のスライド上の幼虫の配置。幼虫プレップがダウン筋肉の面を上にしてキューティクルの側面を露出していることを確認します。各サンプルの間に少なくとも幼虫の体の幅のままにしておきます。 <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。ときイメージング、関心の筋肉とセグメントを探します。一般的な神経筋接合部では、支配する筋肉​​の6 / 7、筋肉13、筋肉12、または筋肉4を特徴とする。腹側正中線の反対側に、示されて半セグメントの鏡像の筋肉の構造があります。あなたが撮影であるセグメントを識別するマーカーとして筋31を使用してください。定量化のために使用することができる遺伝子型ごとに多数のシナプスの画像を収集してサンプルの残りの画像と同じシナプスとセグメント、。 <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。NMJ神経支配筋6月7日の部分の代表的な最大の投影画像が表示されます。 NC82（Bruchpilot）染色は緑で表示されます。 HRPシナプス前染色は赤色で表示されます。さらに画像処理ソフトウェアによって定量することができるアクティブゾーンpunctaeに注意してください。

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	<li>Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+maturation+and+structural+plasticity+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions.</a> Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).</li><li>Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot.">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).</li><li>Hoang, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Synapses.">Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses.</a> Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).</li><li>Keshishian, H., Kim, Y. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+development+and+function:+retrograde+BMP+signaling+in+the+Drosophila+nervous+system.">Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system.</a> Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).</li><li>Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+Promotes+Active+Zone+Assembly,+Ca2++Channel+Clustering,+and+Vesicle+Release.">Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release.</a> Science. 312, 1051-1054 (2006).</li><li>Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+neuromuscular+junction:+Molecular+components+and+mechanisms+underlying+synaptic+plasticity.">Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity.</a> Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li><li>Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+ALS:+human+ALS-associated+mutation+in+VAP33A+suggests+a+dominant+negative+mechanism.">A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism.</a> PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).</li><li>Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., D&#252;rrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot,+a+Protein+with+Homology+to+ELKS/CAST,+Is+Required+for+Structural+Integrity+and+Function+of+Synaptic+Active+Zones+in+Drosophila.">Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTNAP2+and+NRXN1+are+mutated+in+autosomal-recessive+Pitt-Hopkins-like+mental+retardation+and+determine+the+level+of+a+common+synaptic+protein+in+Drosophila.">CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila.</a> Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ニューロンは、シナプス終末の面積は非常に重要であり、そしてポストとシナプス前細胞との間の適切な通信のためのブリッジです。疾患モデルにおけるニューロンの健康を調査する強力な方法は、免疫蛍光法によりシナプス末端のタンパク質を分析することです。ここで紹介する免疫蛍光法では、グループ間の環境の違いを制限しながら、研究者は、同時に多くの幼虫を調べることができ?...

<table border="1"><tbody><tr><td>試薬の名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td> Sylgard 184シリコーンエラストマー基地</td><td>ダウコーニング</td><td> 68037-59-2 </td><td>混合後、遅いローテーターに置いたり、30分以上放置することにより、ゆっくりと上昇する気泡を可能にする。 </td></tr><tr><td>ステンレス鋼Minutienのピン</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 26002〜10 </td><td>約にトリム。定期的にハサミで長さが3〜4ミリメートル</td></tr><tr><td>椎弓切除鉗子（ピンを把握するための平滑に使用） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11223〜20 </td><td>ピンをつかむのに鈍鉗子として使用</td></tr><tr><td>解剖の鉗子</td><td>世界の精密機器</td><td> 501985 </td><td></td></tr><tr><td>超Vannasはさみ、長い8センチメートル</td><td>世界の精密機器</td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td>マウス抗- BRPの抗体</td><td> DSHB </td><td> NC82 </td><td> 1:50希釈して使用</td></tr><tr><td> Cy3のAffinipureのヤギ抗ホースラディッシュペルオキシダーゼ</td><td>ジャクソンイムノ</td><td> 123-165-021 </td><td> 1:200希釈で使用</td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗マウスIgG </td><td>インビトロジェン</td><td> A11001 </td><td>約を使用してください。 1:200希釈</td></tr></tbody></table>

dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction

ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部（NMJ）は、シナプスの構造と機能の研究のための優れたモデルである。 ショウジョウバエは、強力な遺伝子操作の容易さのためによく知られており、幼虫の神経系は正常な機能にも乱れていないだけの研究に特に役立っていますそれは、いくつかの神経疾患（ロイドとテイラー、2010年）同行。 ショウジョウバエに見られる多くの重要なシナプス分子はまた、哺乳類で発見され、ほとんどのCNS ​​のような哺乳動物ではシナプスを興奮している、 ショウジョウバエ NMJはグルタミン酸作動性であり、活性依存性リモデリング（島ら 、2000）を示しています。それらの神経支配のパターンは、ステレオタイプとそれが可能などの運動ニューロンとそれが支配することが体壁筋線維（Keshishianと金、2004）との間のものとして特定されたシナプスの端末を、勉強することの繰り返しなので、さらに、 ショウジョウバエの神経細胞を個別に識別することができます。遺伝子と物理操作の容易さとともに、進化的に保存シナプスのコンポーネントの存在は、シナプス機能（Budnik、1996）基礎となるメカニズムを調べるためのショウジョウバエモデルに最適です。 これらは神経伝達物質の放出の部位であるので、シナプスの端末でアクティブなゾーンは、特に興味深いものである。 NC82は、 ショウジョウバエのタンパク質Bruchpilot（BRP）、アクティブゾーン（Wagh ら 、2006）の重要なコンポーネントであるCAST1/ERC家族を認識するモノクローナル抗体である。 BRPは、直接、アクティブなゾーンのT -バーを形成することが示さと効果的にTバーの密度の下のCa 2 +チャネル（フーケら 、2009）クラスタリングを担当した。 BRPの変異体は、Ca 2を削減しました+チャネルの密度は、落ち込んで誘発小胞放出、および変更された短期可塑性（キッテルら 、2006）。アクティブなゾーンへの変化は、 ショウジョウバエの疾患モデルで観察されている。例えば、NC82抗体を用いた免疫蛍光は、アクティブなゾーンの密度が筋萎縮性側索硬化症とピット-ホプキンス症候群のモデルで減少したことを示した（Ratnaparkhi ら、2008;。。Zweierら 、2009）。したがって、アクティブなゾーン、または他のシナプス蛋白質の評価は、疾患のショウジョウバエの幼虫のモデルでシナプスの欠陥の存在の貴重な初期の手がかりを提供することがあります。 NMJの免疫蛍光分析のための準備ホールマウント解剖ショウジョウバエの幼虫は、いくつかのスキルが必要ですが、少し練習すれば、ほとんどの科学者によって行うことができます。発表は各遺伝子型間の環境の違いを制限し、再現性と統計分析の信頼性のために十分な動物を提供する、解剖と同じ解剖皿の中で免疫染色するために複数の幼虫のために提供する方法です。

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Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

の神経筋接合部（NMJ）<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;正常なシナプス機能だけでなく、特定の神経疾患に見られるシナプス機能への摂動を研究するための重要なモデル系である。我々は解剖のためのプロトコルを提示<em&gt;ショウジョウバエ</emNMJ内のアクティブゾーン蛋白質のための&gt;幼虫のモータシステムと免疫染色。

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

dissection-imaging-active-zones-drosophila-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

15.3K ビュー.  St. Jude Children’s Research Hospital. の神経筋接合部（NMJ）キイロショウジョウバエ正常なシナプス機能だけでなく、特定の神経疾患に見られるシナプス機能への摂動を研究するための重要なモデル系である。我々は解剖のためのプロトコルを提示ショウジョウバエ幼虫のモータシステムと免疫染色。

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Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

シングルショウジョウバエ個眼の解剖とイメージング

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

神経科学

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

シーケンシャル神経筋接合部におけるシングルシュワン細胞の輪郭を描くのにフォトブリーチング

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

全マウント神経筋接合解析のための トランス対アブドミン筋 の解剖

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

の検出<em&gt;その場で</emで&gt;タンパク質 - タンパク質複合体<em&gt;ショウジョウバエ</em近接ライゲーションアッセイの使用&gt;幼虫神経筋接合部

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経筋接合部

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ブレインズ

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

神経筋接合部機能を測定

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

高スループットとのマルチパラメトリック定量化のための2個のアルゴリズム<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;神経筋接合部形態

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部のシナプス電流の焦点 Macropatch 録音

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

認識された運動ニューロンの神経筋接合部における変化を検出する ショウジョウバエ 成脚の解剖と免疫染色

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...