酵素保護アッセイは、ステープルアウレウスの内在化の程度と、接着細胞内で生き残る能力、ならびに抗菌性化合物の有効性を研究することを可能にする。改善された酵素保護アッセイは技術的な取り扱いを大幅に簡素化し、弱接着性細胞および懸濁液中の細胞から内在化細菌を回収することを可能にする。手順を実証するには、私の研究室の医師で博士課程の学生であるジョセリン・リガイルです。
感染アッセイの2日前に、種子A549上皮細胞は、24ウェルプレートのウェル当たり1ミリリットル当たり2.0倍から5番目の細胞の密度で、100%合流するまで5%の二酸化炭素で摂氏36度で48時間培養する。アッセイの日には、A549細胞を数えるために専用の3つのウェルから使用済み培養培地を取り除いて捨て、1ミリリットルの完全な感染培地を1ミリリットルずつ添加し、1ミリリットルのHoechst 33342と1ミリリットルのヨウ化プロピジウム1ミリリットル当たり1マイクログラムを含有する。細胞を30分間インキュベートし、次いで広視野蛍光顕微鏡を用いて、細胞数を数え、細胞の生存率を算出する。
細菌懸濁液を調製するには、チューブ内の完全な感染媒体の25ミリリットルを分配し、摂氏36度でそれを予熱する。次に、細胞密度計を用いて完全な感染培地で0.5のODにブドウ球菌懸濁液を調整し、次いで完全な感染培地で培養物を希釈して細胞接種のための細菌懸濁液を20ミリリットル調製し、1つの細胞数に応じて1つのMOIを達成する。次に、自動スパイラルプラターを用いて、細胞接種工程に使用する希釈細菌懸濁液の黄色ブドウ球菌負荷を決定し、摂氏36度で18〜24時間寒天プレートをインキュベートする。
翌日、コロニーカウンターを持つコロニーの数を数え、検査された各株の正確なMOIを計算します。細胞接種前に、低倍率顕微鏡で24ウェルプレートの全ウェルを観察し、細胞が健康で期待通りに成長していることを確認し、24ウェルプレートから使用済み細胞培養培地を取り除いて捨て、100%コンフルエント細胞を含む各ウェルに500マイクロリットルの細菌懸濁液を加えます。5%の二酸化炭素で摂氏36度で2時間細胞をインキュベートする。
改善された酵素保護アッセイを用いて細胞内細菌を定量化するために、4xリシスバッファー、2%トリトンX-100、トリプシン-EDTA、およびリソスタフィンストックをテキスト原稿に記載されているように作業溶液中で調製する。次に、リソスタフィンの働く溶液の250マイクロリットルに完全な感染培地の6ミリリットルを加えることによってリソスタフィンを補充する完全な感染培地の6.25ミリリットルを調製する。次に、リソスタフィンを添加した完全な感染培地を250マイクロリットルを各ウェルに加え、手でプレートを回転させることでプレートを軽く攪拌する。
リソスタフィンが細胞外細菌を殺すことを可能にするために、細胞を5%の二酸化炭素で摂氏36度で1時間インキュベートし、各ウェルに10マイクログラムのプロテイナーゼKを10マイクロリットルずつ加えてリソスタフィンを不活性化し、室温で2分間細胞をインキュベートする。次に、4倍のリシスバッファーを250マイクロリットル加えて、浸透衝撃で細胞を分解し、36°Cで10分間細胞をインキュベートします。インキュベーション後、ピペット細胞は、細胞が完全に分解され、均質化されていることを確認するために数回上下にリセートし、その後、各ウェルの黄色ブドウ球菌の負荷を決定し、摂氏36度で18〜24時間寒天プレートをインキュベートするために自動スパイラルプラターを使用します。
翌日、コロニーカウンターを有するコロニー数をカウントし、各ウェルの細胞内ブドウ球菌負荷を計算する。A549上皮細胞による黄色ブドウ球菌の2株の内在化をここに示す。リソスタフィンを除去するスメシュを含む酵素保護アッセイを用いて、平均細胞内負荷は、SF8300野生型およびfnbAおよびB遺伝子を欠く等原性変異体に対して、ミリリットル当たり4.46および0.49ログcfuであった。
リソスタフィンを不活性化するためにプロテナーゼKを使用する改善された酵素保護アッセイを使用して、負荷はそれぞれ1ミリリットル当たり4.53および0.56 log cfuであった。酵素保護アッセイを用いて測定した黄色ブドウ球菌に対するバンコマイシン、リファンピシン、およびレボフロキサシンの細胞内活性をここに描く。平均細胞内負荷は、対照用のミリリットル当たり4.57ログcfu、バンコマイシンの場合は4.51、リファンピシンでは3.03、レボフロキサシンでは2.91である。
酵素を除去するための集中的な打ち込みは、最も感染した細胞を取り外す傾向があり、不正確な結果を与え、改善されたプロトコルの使用をサポートする可能性があります。酵素保護アッセイの改善により、臓器不同でのステープル・アウレウス内装の研究が容易になり、パッティングにより使用される高含有スクリーニングシステムに容易に適応可能
