ダニーロMaddaloは、カールスルーエ工科大学から若手研究者グループ（YIG）などの研究フェローシップの受賞者です。

1。細胞を播種<ol><li>開始する前に、37℃の水浴中に培地、PBS 1Xおよびトリプシンをウォームアップ˚C </li><li>インキュベーターから細胞を取り出し、培地を吸引除去する。 </li><li>静かにそれらを洗浄する細胞にPBS 1X 5 mLを適用する。 </li><li> PBS 1Xを吸引し、0025パーセントEDTAを含有するトリプシンの1 mLを適用します。 </li><li>ゆっくりとトリプシンの均一な分布を持つようにプレートを回転させる。 </li><li> 37℃インキュベーターで細胞を配置˚C、5〜10分間（細胞の種類によって異なります）。時間からの細胞がプレートを振とうすることにより切り離されているかどうかを確認時に。 </li><li>培地の10〜20 mLで細胞を再懸濁し、50mlファルコンチューブでそれらを収集する。 </li><li>ベックマンのカウンタを使用してセルを数える。細胞の数は約60〜70％の合流を確保するために十分なはずです。 </li><li>プレート細胞と6〜8時間のためにシードするためにそれらを許可する。 </li></ol> 2。トランスてトランスフェクション<ol><li>トランスフェクションに先立ち、˚37℃の水浴中で無血清培地のアリコートをウォームアップ</li><li>室温にX -番手ジーン9をもたらす。 </li><li>ピペットで2エッペンドルフチュー​​ブ（1チューブ= 1トランスフェクション）の無血清培地。 </li><li>先端が5分間エッペンドルフおよびインキュベートのプラスチック製の壁に接触しないように注意を払って無血清培地でのピペットX -番手遺伝子9。その間に二つのDNAミックスを準備する：1本のチューブに別のチューブのシイタケ、ホタルと分子シャペロンで、シイタケ、ホタルと空のベクトル制御のためのプラスミドを一緒に混ぜる。 </li><li>無血清培地の+ X -番手遺伝子9、20分間室温でボルテックスし、インキュベートを含む各エッペンドルフにDNAミックスを追加。 </li><li> ℃、5％CO 2 37℃で24時間各プレートとインキュベートに各ミックスを滴下して追加します。 </li></ol> 3。分裂細胞<ol><li>トランスフェクション24時間後、tryps1.4で説明したように細胞inize - 1.6を、6ウェルプレートで60から70パーセントの最後のコンフルエンシーにそれらを希釈する。 </li><li>非ショック制御のために一つのプレートを準備して分析する必要が復旧時点と同じくらい多くのプレートは、 図3に示した。 2。 </li></ol> 4。熱ショック<ol><li>熱ショック、37℃水浴中で培地を含有するプレ暖かい血清˚Cの</li><li> 20μg/ mlの20 mMのMOPSへの最終濃度に血清含有培地のシクロヘキシミドで希釈することによって&quot;熱ショックバッファ&quot;を準備します。 </li><li>今インキュベーターからプレートを取り出し、培地を吸引除去する。 </li><li> &quot;ヒートショックバッファ&quot;の各ウェルに1mLに追加し、37℃で30分間インキュベート˚CとCO 2の5％（また、この治療法の基準板を含む）。これは 、de novoタンパク質合成を停止します。 </li><li>水浴上で一方のスイッチにしてtを設定します。45℃emperature˚C. </li><li>インキュベーション後、以前のストライプにカットパラフィルムでプレートのふたを密封する。基準板（refolfedホタルの100％）インキュベーターに残されている。 </li><li> ˚Cで30分間45℃培養する。 </li><li>水浴から板を削除する、パラフィルムを除去し、回復を可能にするためにインキュベーターにバックプレートを置く。 </li><li>各時点の収穫で、細胞と˚Cの4℃で1分間2000Xgで遠心分離することによってPBS 1Xでそれらを洗う</li></ol> 5。細胞溶解とルシフェラーゼアッセイ<ol><li>効率的な細胞溶解のために、液体窒素中で細胞ペレットを凍結スナップ。 </li><li>ガラス管に蒸留水で1:5に希釈した受動的溶解緩衝液200μlを追加。 </li><li> 96ウェルプレートに細胞ライセート30μlを添加する。各サンプルは三重にピペットで入れる。 </li><li>唯一の&quot;非ショック&quot;参照サンプルがするために使用されます。この手順は同じトランスフェクション効率を確認するために使用されているため、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を読んで。 </li><li>アッセイのためのソリューションを準備する。ルシフェリン溶液のためのGly - Glyは、バッファ内の0.2mMの最終濃度にルシフェリンを希釈する。反応バッファーのためのGly - Glyのバッファに1mMの最終濃度になるようにDTTとATPを希釈する。セレンテラジンの反応バッファーの場合は、セレンテラジンのバッファで0.2μMの最終濃度にセレンテラジンを希釈する。ルシフェリン溶液とセレンテラジンの反応バッファーのライトプロテクトをしてください。 </li><li>今ルミノメーターに96ウェルプレートを配置し、プログラム&quot;ワラック1420ワークステーション&quot;を開始します。 </li><li>セレンテラジン溶液の入ったファルコンチューブにPump1を導入する。光がチューブに接触することはできませんので、蓋を閉じます。 </li><li>オプション&#39;ディスペンサーのメンテナンス&quot;メニューから選択し、Pump1をチェックします。 </li><li>オプション&#39;fill&#39;を選択します。 </li><li>プレートレイアウトオプションを選択する編集するには、メニューの&quot;プロトコルと結果を見る&quot;。その上のプロトコルとダブルクリックを選択します。今読まれる井戸を選択します。 </li><li> &quot;ワラックマネージャ&quot;に戻り、&quot;スタート&quot;をクリックします。ウミシイタケルシフェラーゼおよびその基質セレンテラジンとの反応は、482 nmのピーク波長で発光する。 </li><li>お読みになったあと、&quot;ディスペンサーのメンテナンス&quot;に行くとチューブに戻し、すべての残液を解放するために&quot;空&quot;とPump1]を選択します。 </li><li>今水の入ったファルコンチューブにチューブを移動し、&quot;フラッシュを&quot;ダニ。 </li><li>フラッシング工程の後に、&quot;空&quot;を選択することでチューブを空にします。 </li><li>反応バッファーファルコンチューブにPump1とルシフェリンファルコンチューブにPump2から一からチューブを置きます。 </li><li>プレートのレイアウトを変更。 </li><li> &quot;ディからPump1とPump2ために&quot;塗りつぶし&quot;を選択しますスペンサーメンテナンス&quot;メニュー。 </li><li>プロトコルを選択して、読み取りを開始します。ホタルルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンとの反応は、560nmのピーク波長で発光する。 </li><li>読書の終わりにPump1とPump2の空 - フラッシュ - 空の手順を繰り返します。 </li><li>結果は、&quot;ワラック1420エクスプローラ&quot;で利用できるようになりました。 </li><li>各実験は、検定番号に関連付けられている、ユーザ名、開始と日付を終了します。 </li><li>結果は、現在、Excelファイルとしてエクスポートすることができます。 </li><li> 1：計算では、細胞を3グループに分かれています。非ショックリファレンスサンプル（リフォールディングホタルルシフェラーゼの100％と設定）、2。分子シャペロンと熱ショックなしで細胞を、3。分子シャペロンと熱を持つ細胞がショックを受けた。 </li></ol> 6。代表的な結果タンパク質のリフォールディングは、直接システムがプロに動作しているかどうかをテストするため、回復の時間に関連しています<html> perly、アッセイは、異なる時点で細胞を集め実行する必要があります。直接的な相関時間/リフォールディングの割合は、実験が適切に実施し、そのための制限要因を表していることを示しています。しかしそれは、常に熱ショック後にリフォールディングする飽和イベントであるため、適切な時間経過の分析は、任意の実験を開始する前に実行する必要があることを考慮すべきである。 <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig1.jpg" alt="図1"/> 図1実験の概要 。 in vivoでリフォールディングのアッセイで完了するまでに3〜4日を要します。日に1細胞を播種し、トランスフェクトされる。翌日細胞が小さい形式に分割されているため、3日目では、これらは、熱ショックを受けています。この時点で右の細胞を採取した後、ルシフェラーゼアッセイを実行するか、-80 ° Cで細胞ペレットを保存し、別の瞬間にアッセイを行うことが可能である_content&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig2.jpg" alt="図2"/> 図2セルの分割 。 2日目の細胞を6ウェルプレートに分割されます。各トランスフェクションを同じプレート上のすべてのトランスフェクションを持たせるために、ウェルに希釈されます。各プレートには、特定の回復時間を加えたノンショック基準板に対応します。 <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。代表良い結果 。リフォールディングのA.の割合は、直接ホタルルシフェラーゼ活性により測定。各棒グラフは、別の回復時間の点での分子シャペロンの不在下でリフォールディングの割合（黒棒）及び存在下で（赤いバー）を表します。不在（黒線）およびシャペロンの存在（赤線）の時間とリフォールディングの間にBの相関。 R二乗値は良好な相関を示している。 回線のg.3Aは、細胞が15、30、45、60、120分不在の熱ショック（黒棒）の後に、分子シャペロンの存在（赤棒）で収集された代表的な結果を示されています。の割合は、長期の回復時間とし、分子シャペロンのトランスフェクションとルシフェラーゼが増加してリフォールディング。制御のためのリフォールディングと時間との相関関係（ 図3B、黒線）と分子シャペロン-トランスフェクト細胞（ 図3B、赤色の線）が表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig4.jpg" alt="図4"/> 図4代表的な悪い結果 。リフォールディングのA.の割合で直接ルシフェラーゼ活性により測定。各棒グラフは、別の回復時間の点での分子シャペロンの不在下でリフォールディングの割合（黒棒）及び存在下で（赤いバー）を表します。存在しない場合と存在感で、時間とリフォールディングの間にBの相関（レッドLシャペロンのジアミン）。 R二乗の値が不正な相関関係を示している。 図4Aは。正しく行わない実験の代表的な結果を示しています。制御（黒棒）と分子シャペロン-トランスフェクション細胞（赤棒）の両方は、時間の経過とともにリフォールディングタンパク質の増加を示していない。さらに、分子シャペロンのトランスフェクションは、リフォールディングの増加には至っていない。この貧しい相関関係を図で確認されている。制御（黒線）と分子シャペロン-トランスフェクション細胞（赤線）のためにそれぞれ0.6619と0.1882のR二乗値を示す4B。

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	<li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+and+protein+quality+control.">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li><li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+heat+shock+response.">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li><li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins.">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li><li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+proteins+and+drug+resistance.">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li><li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology.">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li><li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer.">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG:+mechanisms+of+antitumour+activity.">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP70+for+cancer+therapy.">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li><li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats.">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li><li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK,+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage.">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li><li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate.">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li><li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease.">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li><li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity.">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

本研究では分子シャペロンの細胞内のリフォールディング活性を測定するためのプロトコルが表示されます。 図の概要が示すように全体のアッセイは、3〜4日で行うことができます。 1。 ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼによって生成される光信号の堅牢性と直線性は、プロトコルの再現性のための強固な基盤を表しています。 <p cla...

この実験のためにルミノメーターのフォームパーキンエルマー&#39;1420ルミネッセンスカウンター&quot;ベクトルの光&quot;が使用されましたルミノメーターのためのプログラム： ウミ：ポンプ1、100μlの注入反応バッファー：Pump1、70μlの注入ルシフェリン：Pump2、30μlの注入バッファは再蒸留水でこれらのストック溶液を調製するため： <ul style="list-style:none"><li> - 1M MgSO 4を 1リットルの246,48グラムのMgSO 4 * 7H 2 O </li><li> - 0,5 M EGTA：1リットル190,18グラムEGTA </li><li> - 1M KH 2 PO 4：1リットル136,09グラムKH 2 PO 4 </li><li> - 1M K2 HPO 4：228,23グラムK 2 HPO 4 1リットル* 3H 2 O </li><li> - 5M NaClを 1リットルの292,2グラムのNaCl </li><li> - 0,5 M EDTA：1リットル186,12グラムEDTA * 2H 2 O &nbsp;</li></ul> GLY - GLY -バッファ： <ul style="list-style:none"><li> - 25mMのGlycylglycin </li><li> - 15mmのMgSO 4を </li><li> - 4MM EGTA </li></ul> 1M硫酸マグネシウムソリューションと0,5 M EGTA溶液を8ミリリットルの15ミリリットルGlycylglycinの1リットル用の3,3 gの。水で解決する、7,8にpHを調整し、1リットルの総容積にもたらす。 シイタケ/セレンテラジンバッファの反応バッファー： <ul style="list-style:none"><li> - ＆nbのSP、13,4 mMのKH 2 PO 4 </li><li> - 86,6 mMのKH 2 PO 4 </li><li> - 0,5 MのNaCl </li><li> - 1mMのEDTA </li></ul> 1M KH 2 PO 4溶液を1リットルの使用13,4 mlの0,5 M EDTA溶液の5M NaCl溶液と2ミリリットルの100ミリリットル1M K 2 HPO 4溶液86,6 mlのために。 <table border="1"><tr><td></td><td> 会社 </td><td> カタログ/製品番号： </td></tr><tr><td> DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地1X） </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> ウシ胎児血清ゴールド </td><td> PAA </td><td> A15 - 151 </td></tr><tr><td> X -番手ジーン9 DNAトランスフェクション試薬</td><td>ロッシュ</td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水1Xをバッファ</td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> MOPS 3 - （N -モルホリノ）プロパンスルホン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M1254 </td></tr><tr><td> シクロヘキシミド </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C7698 </td></tr><tr><td> 受動的溶解バッファー5X </td><td>プロメガ</td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4を乾燥（MgSO 4 * 7H 2 O） </td><td>シグマアルドリッチ ロート ロート</td><td> G7278 3054.2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4（K 2 HPO 4 · 3H 2 O） NaClを EDTA </td><td>ロート ロート ロート ロート</td><td> 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 </td></tr><tr><td> ルシフェリンホタル </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> セレンテラジン </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT（ジチオスレイトール） </td><td>ロート</td><td> 6908.2 </td></tr><tr><td> ATP（アデノシン三リン酸） </td><td>ロッシュ</td><td> 10519987001 </td></tr></table>

intracellular refolding assay

このプロトコルは、セルベースの​​システムと抑制性/刺激活性を持つ化合物の可能性のある影響で、分子シャペロンの酵素活性を測定する方法を説明します。分子シャペロンは、1を折るタンパク質の調節に関与するタンパク質であり、熱ショック2のようなストレスの侮辱、栄養飢餓および化学薬品/毒3に曝すと細胞の生存を促進する上で重要な役割を持っている。このような理由からシャペロンは、腫瘍の開発、がん細胞4のchemioresistanceだけでなく、神経変性5のようなイベントに関与していることが発見されています。これらの酵素の活性を阻害または刺激することができる小分子の設計は、したがって、癌治療7と神経変性疾患9のほとんどの研究戦略の1つです。ここに記載のアッセイは、特定の分子シャペロンのリフォールディング活性を測定すると、コンピュータの効果を研究する可能性を提供その活動上ounds。この方法で調査、分子シャペロンの遺伝子は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターのエンコーディングと一緒にトランスフェクトされる。それはすでに変性ホタルルシフェラーゼが分子シャペロン10,11によってリフォールディングすることができることが記載されている。トランスフェクションのコントロールを正常化するとして、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子のコードするベクターをトランスフェクトされる。このプロトコルで説明されているすべてのトランスフェクションは、HEK - 293細胞におけるX -番手ジーン11（ロシュ）で実行されます。最初のステップでは、タンパク質合成は、シクロヘキシミドで細胞を処理することにより阻害される。その後、アンフォールディングタンパク質は、30分間45℃での熱ショックによって誘導される。 37回復° C時には、タンパク質はその活性コンフォメーションに再折り畳まれているとホタルルシフェラーゼの活性は、読み出しとして使用される：より多くの光が生成される、より多くの蛋白質は元のコンフォメーションを再度得ているだろう。非熱ショック細胞は、参照（リフォールディングの100％として設定されていますルシフェラーゼ）。

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Intracellular Refolding Assay

このプロトコルでは熱ショック後に細胞内タンパク質のリフォールディングを測定する方法が記載されている。このメソッドは、その活性に影響を与えることができる分子シャペロンとその補因子または化合物のようなfoldasesを研究するために使用することができます。ホタルルシフェラーゼ活性は、シャペロンのリフォールディング活性を測定するためのレポーターとして使用されます。

細胞内のリフォールディングアッセイ

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K ビュー.  Karlsruhe Institute of Technology. このプロトコルでは熱ショック後に細胞内タンパク質のリフォールディングを測定する方法が記載されている。このメソッドは、その活性に影響を与えることができる分子シャペロンとその補因子または化合物のようなfoldasesを研究するために使用することができます。ホタルルシフェラーゼ活性は、シャペロンのリフォールディング活性を測定するため...

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

生物学

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

光活性化GFPでAPPの細胞内輸送をイメージング

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

精製とのアミロイド線維にリフォールディング（彼）<sub&gt; 6</sub&gt;内封入体として発現された組換えShadooタンパク質をタグ付き<em&gt;大腸菌</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

隣接セル受けてアポトーシス細胞死との相互作用によって生細胞に誘導されるイベントを細胞内シグナルの同定

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

蛍光遺伝子にコードされた pH インジケーターとキイロショウジョウバエのマルピギー氏管の上皮細胞で光の定量化の細胞内 pH

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

レンズ無料のビデオ顕微鏡、付着性細胞培養の定量的解析

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...