この作品は、省の科学と技術 (PCC にほとんど、105-2320-B-010-007-MY3)、国立衛生研究所 (NHRI - PCC に EX105-10215BC)、科学技術 (最も 105-2314-B-400-019 省からの助成金によって支えられました。HJK) して国立衛生研究所 (NHRI MG-105-SP-10、HJK に NHRI の MG-106 SP-10) から。この作品も、PCC に原稿出版物の国立陽明大学と部分的サポートされていました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の賠償の役割はなかった。

1. バキュロ ウイルス発現コンストラクトの調製
<ol><li>
相撲 E3 リガーゼ K bZIP 浄化デュアル式バキュロウイルスベクターへ K bZIP19の cDNA のクローニング (材料表参照) N 末端エピトープ タグ付き。(ベクトル-タグ-K-bZIP としてプロトコルを通して示される) オクタペプチド タグを使用して成功を収めています。 注: K bZIP ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) のクローニングのための DNA のテンプレートは cDNA の逆ドキシサイクリン治療20TREx F3H3 K-Rta BCBL 1 細胞由来 RNA から転写です。<ol>
<li>サイトのクローンを作成私Cpoとデュアル発現ベクターにフルレングスの K bZIP cDNA19を転送します。Cpo私は PCR の製品や 3 h2137 ° C でデュアル発現ベクターの 1 μ g を消化します。</li>
		<li>分離・220.8% の agarose のゲルの電気泳動、次消化の DNA を抽出します。挿入 (K bZIP) を縛るし、製造元の指示に従って 30 分の 16 ° C T4 DNA リガーゼによるベクトル (材料の表を参照してください)。</li>
		<li>5 μ L を追加 50 μ L に結紮 DNA の有能なエシェリヒア属大腸菌細胞」(参照材料表) 1.5 mL チューブ。30 分間氷の上に置きます。45 42 ° C の水浴に 1.5 mL チューブをインキュベーションして、s およびすぐにチューブを入れて 3 分間氷の上。</li>
		<li>チューブに 600 μ L まで媒体 (0.5% (w/v) 酵母エキス、2% (w/v) トリプトン、10 mM の NaCl、2.5 mM KCl、20 mM MgSO4、および 4% (w/v) グルコース) を追加し、37 ° C 1 時間インキュベートします。その後、600 x g で 3 分間室温でチューブを遠心分離機します。</li>
		<li>上清を除去、60 μ ルリア ベルターニカミラ培地でペレットを再懸濁します (LB; 1% (w/v) トリプトン 0.5% (w/v) 酵母エキス、85 mM の NaCl) と 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB 寒天培地プレート上に広がる。16 h23,2437 ° C で寒天版を孵化させなさい。</li>
		<li>1 植民地揺れ 250 rpm で 100 μ g/mL アンピシリンと 16 h の 37 ° C で培養を含む 5 mL の LB 培地に接種するを選択します。その後、製造元の指示に従ってプラスミド抽出キットによってベクトル タグ K bZIP プラスミドを抽出 (材料の表を参照してください)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ベクトル タグ K bZIP の有能なエシェリヒア属大腸菌への変換によってタグ K bZIP をかくまっている組換えバクミドを生成する細胞"B"(材料の表を参照してください)。
	<ol>
<li>0.2 μ g ベクター-タグ-K-bZIP プラスミドと 100 μ L を混在させる有能なe.大腸菌細胞"B"1.5 mL チューブと置かれた氷 30 分インキュベート 45 42 ° C の水浴中管 s およびすぐにチューブを入れて 3 分間氷の上。</li>
		<li>チューブにまで中の 900 μ l 添加し 50 rpm で回転と 4 h の 37 ° C で孵化させなさい。次に、媒体の 10 μ L を取る、50 μ G/ml カナマイシン、7 μ g/mL ゲンタマイシン、10 μ G/ml テトラサイクリン、100 μ g/mL ガラクトシダーゼの基質、40 μ g/mL イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG を含有 LB 寒天培地プレート上を広めるための S.O.C メディアの追加の 50 μ L を追加)、37 ° C で 48 h 用の版を孵化させなさいと</li>
		<li>50 μ G/ml カナマイシン、7 μ g/mL ゲンタマイシン 10 μ G/ml テトラサイクリンを含む 5 mL の LB 培地の白いコロニーを接種します。250 rpm の 16 h の揺れは、37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>タグ K bZIP をかくまっている DNA の組換えのバクミドを分離、定量化、および再濃度 1 μ g/μ L25で中断します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
組換えバクミド 6 ウェル プレートのウェル 1 個で Sf9 細胞にタグ K bZIP を含んでいる DNA の 1 μ g を株でタグ K bZIP を表現する組換えバキュロを生成します。
	<ol>
<li>10% 牛胎児血清 (FBS) とそれぞれ 1% ゲンタマイシン 2 mL グレースの昆虫中種子 2 x 106 Sf9 細胞 (材料の表を参照してください) 6 ウェル プレートのよくし、27 ° C 1 時間インキュベートします。</li>
		<li>Sf9 細胞 10 %fbs、ゲンタマイシン 1%、1% 洗剤 C 付属グレースの昆虫中のログ相培養を維持 (材料の表を参照) で 140 rpm で軌道懸濁液 27 ° C。検定とトリパン ブルー染色; を使用してセルをカウントします。細胞生存率は、95% を超える必要があります。継代培養の比が 1:3 すべての 2-3 日 (最小密度 ~0.5 x 106セル/mL) を使用してセルを維持します。</li>
		<li>2 μ L バクミド DNA を追加 (1 μ g/μ L) と 98 μ L は、2 mL チューブに血清メディア (材料の表を参照) を削減します。4 μ L のトランスフェクション試薬を加えます (材料表参照) チューブとよく混ぜる。15 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>各ウェルにこのトランスフェクション混合物 (104 μ L) を追加し、27 ° C 12-16 時間インキュベートします。</li>
		<li>穏やかな吸引と排出されるメディアを削除し、10 %fbs と 1% ゲンタマイシンに付属している新鮮な恵みの昆虫培地 2 mL に置き換えます。Sf9 細胞プレート表面に緩く付着し、穏やかな吸引を邪魔されません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
トランスフェクション後組換えバキュロ ウイルスを収集し、さらに実験のための高力価の在庫 (P1) を取得するバキュロ ウイルスを増幅します。
	<ol>
<li>無菌細胞リフターを使用してこすり、Sf9 細胞媒体を変更した後 72 時間は、1.5 mL チューブと 10 の渦でそれぞれ個々 の井戸から上清を収集 s。</li>
		<li>150 x g に 3 分の 4 ° C で遠心分離機の P0 バキュロ ウイルスと 1.5 mL チューブ (各管に 1 mL バキュロ ウイルス) の因数として上澄み。-80 ° C でストア</li>
		<li>10 mL グレースの昆虫中種子 1 x 107 Sf9 細胞 10 %fbs と 1% ゲンタマイシン 10 cm シャーレで付属し、27 ° C 1 時間で孵化させなさい。</li>
		<li>組換えバキュロ発現タグ-K bzip 型の増幅、シード Sf9 細胞に 0.5 mL P0 バキュロ ウイルスを追加し、, 48 h の 27 ° C で。</li>
		<li>1 ヶ月 15 mL チューブと 4 ° C でストアで P1 バキュロ ウイルス上清を収集します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. K bZIP の浄化
<ol><li>1.3.2 の手順の説明に従って 10 %fbs、ゲンタマイシン 1%、1% 洗剤 C 140 rpm で軌道懸濁液中の 27 ° c に付属しているグレースの昆虫中 Sf9 細胞のログ相培養を維持します。</li>
	<li>伝達の日、2 x 106セル/ml の密度と Sf9 細胞の 250 mL にバキュロ ウイルスを含む上清 (P1) の 1 つの mL を追加します。</li>
	<li>揺れ、140 rpm と軌道シェーカーで 27 ° C、72 時間 Sf9 細胞を孵化し、4 ° C で 15 分間 2,740 × g で遠心分離によって収集</li>
	<li>上清を除去し、10 mL の溶解バッファー (20 mM HEPES pH 7.9, 0.5 M の NaCl、1% 洗剤 (材料の表を参照)、2% グリセロール、プロテアーゼ阻害剤のカクテル) 細胞ペレットを溶解、4 ° C で 30 分間懸濁液ミキサーを使用して 50 rpm で回転。</li>
	<li>遠心分離機にて細胞培養上清を収集するために 15 分間 15,000 × g。</li>
	<li>タグ K bZIP を浄化するために 14 mL ポリプロピレン チューブに抗体タグ磁気ビーズの 50 μ L と細胞溶解液 (10 mL) を孵化し、懸濁液ミキサーを使用しての 4 ° C で 3 時間 50 rpm で回転します。30 g 遠心 x 800 でビーズをペレット蛋白質のキャプチャ、次 4 ° C で s上澄みのほとんどを取り外し、再度約 1 mL、残気量のビーズを中断、洗濯用 1.5 mL チューブに。</li>
	<li>マグネット スタンドにビーズを含むチューブを配置することによってキャプチャされたタンパク質を洗浄し、磁気ビーズが完全に管の側に付着した後、上澄みを除去します。</li>
	<li>
換散バッファーのビード 4 回洗浄しなさい。
	<ol>
<li>1.5 mL チューブに 1 mL の溶解バッファーを追加し、10 回チューブを反転します。マグネット スタンドに 1.5 mL チューブを置き、2.7 で説明されているように、上清を除去します。</li>
		<li>別の 3 回前の手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でビーズを一度洗ってください。
	<ol>
<li>1.5 mL チューブに 1 mL の PBS (137 mM NaCl、KCl、2.7 mM 8 mM Na2HPO4、1.5 mM KH2PO4) を追加し、10 回チューブを反転します。</li>
		<li>マグネット スタンドに 1.5 mL チューブを入れ、上澄みを取り外します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 mL チューブに PBS で希釈した 150 μ g/mL オクタペプチドの 100 μ L を追加することによって磁気ビーズの抗体タグからタグ K bZIP 蛋白質を溶出します。室温で懸濁液ミキサーで 50 rpm で 10 分間のチューブを回転させます。マグネット スタンドにチューブを配置し、きれいな 1.5 mL チューブに K bZIP 含む上清を収集します。</li>
	<li>SDS-PAGE ブルー26を染色の順で 1-5 μ L の精製タグ K bZIP 蛋白質を分析します。負荷 2 μ、1 μ g と同じウシ血清アルブミン (BSA) の 0.5 μ g のサンプルはゲルし ImageJ のような画像処理プログラムと定量化のためにそれを使用します。BSA の標準に比較して K bZIP 濃度を推定します。</li>
	<li>精製 K bZIP は、各 sumo 化アッセイに使用する準備が整いました。PBS で K bZIP を 100 ng/μ L と小さい因数-80 ° C でストアの最終濃度に希釈します。</li>
</ol>3. sumo 化アッセイ
<ol><li>各体外sumo 化反応のマスターの組合せに精製タグ K bzip 型の 100 ng/μ L の 3 μ L を追加します。マスター ミックスのコンポーネントを含む 1 μ L 蛋白質バッファー、sumo 化バッファー、0.5 μ L p53 蛋白 (0.5 mg/mL)、25 x 1 活性化酵素 E1 の nM (ストック濃度: 1 μ M), 50 nM E2 の酵素の活用 (ストック濃度: 10 μ M)、および 250 相撲ペプチド (相撲 1 の各 nM、相撲-2、または相撲-3;ストック濃度: 5 μ M) 17 μ L の最終巻に。</li>
	<li>軽く内容をミックスし、3 h は SDS ページの読み込みバッファー x 2 の 20 μ L の追加によって反作用を停止するため、30 ° C で反応を孵化させなさい (100 mM トリス塩酸 pH 6.8, ドデシル硫酸ナトリウム 4%、0.2% (w/v) ブロモフェノールの青、20% (v/v) グリセロール、200 mM β-メルカプトエタノール) と95 ° C、5 分でサンプルを変化させなさい。</li>
	<li>
SDS-PAGE のサンプルを分離、半乾燥電気泳動転送装置を使用して PVDF 膜に分けられた蛋白質を転送および抗 p53 抗体を用いたウエスタンブロット分析します。
	<ol>
<li>2.11、ステップのようにゲル装置を設定し、ゲルの井戸に 20 μ L のサンプルを読み込みます。</li>
		<li>(色素のバンドに達するゲルの底) まで約 120 分 80 V で電流定数 10% ゲルを実行します。電気泳動の終了後、電源をオフにします。</li>
		<li>ゲル装置、ゲル、ゲルを取るカセットを外し 5 分半乾燥の転送バッファー (48 mM トリス-HCl、39 mM グリシン、20% メタノール) にゲルをフロートします。</li>
		<li>別のコンテナーを取り出して 1 分のメタノールに PVDF 膜を浸漬します。メタノールの PVDF を取るし、半乾燥の転送バッファーに配置します。5 分間膜を振ちましょう。</li>
		<li>半乾燥電気泳動装置の安全カバーを取り外します。</li>
		<li>事前フィルター ペーパーをウェットし、準備下白金アノードにゲル サンドイッチを次のように: ろ紙、PVDF 膜、ゲル、及びフィルター ペーパー。</li>
		<li>、電源を 15 V 定数 90 分ターン現在でしみを実行して、安全な陰極板と安全カバーは、セミドライ装置を外し、PVDF 膜を取る。</li>
		<li>バッファーを妨げるブロック PVDF 膜 (TBST バッファーで 5%、無脂肪ミルク (137 mM NaCl2、20 mM トリス-HCl、0.1% 洗剤 B (材料の表を参照)、pH 7.6)) 軌道シェーカーで振って 30 rpm で 1 時間室温で。</li>
		<li>30 rpm 振動懸濁液ミキサーを使用して抗 p53 抗体希釈 (1:1, 000) 4 ° C で 12-16 h のブロック バッファーで PVDF 膜を交配させます。</li>
		<li>コンテナーに PVDF 膜を取り出し、TBST で置きます。Tbst 倍 PVDF 膜を洗い流してください。</li>
		<li>軌道シェーカーで振って 45 rpm で 30 分間 TBST で PVDF 膜を浸します。</li>
		<li>30 rpm サスペンション ミキサーを使用して振動を室温で 1 時間ブロッキング バッファーで抗家兎抗体希釈西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) と共役 (1:4, 000) PVDF 膜を交配させます。</li>
		<li>TBST 3 回手順 3.4.10 PVDF 膜を洗浄します。</li>
		<li>45 rpm は、懸濁液ミキサーを使用して振動 TBST で 30 分間の PVDF 膜を浸します。TBST を削除し、12 h まで 4 ° C で PVDF 膜を維持するために PBS を追加します。</li>
		<li>1 と 2 (1:1) (材料の表を参照してください) の化学発光基質 (ECL 基板) 試薬を混ぜます。PBS から PVDF 膜を削除、紙タオルや余分な水分を吸収し、簡単にしみが付くことで 3 ~ 5 分削除過剰な ECL 試薬の各膜の表面に ECL 試薬の 400 μ L を直ちに追加する軽型ワイパーで簡単にしみが、m を許可しません。embrane に完全に乾燥。</li>
		<li>オートラジオグラフィー フィルム27発光イメージング システムを使用してしみを公開します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bies, J., Markus, J., Wolff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+attachment+of+the+SUMO-1+protein+to+the+negative+regulatory+domain+of+the+c-Myb+transcription+factor+modifies+its+stability+and+transactivation+capacity.">Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity.</a> J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).</li><li>Lin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SUMO-interacting+motif+in+Daxx+SUMO+modification,+subnuclear+localization,+and+repression+of+sumoylated+transcription+factors.">Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors.</a> Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).</li><li>Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+Src+Homology-2+domain+containing+protein+B+(SHB)+in+beta+cells.">The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells.</a> J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).</li><li>Huang, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+pathogenesis+of+SHP2+in+developmental+disorders+and+tumorigenesis.">Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis.</a> Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).</li><li>Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SIM-ultaneous+role+for+SUMO+and+ubiquitin.">A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin.</a> Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).</li><li>Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+function+of+RNF4+family+proteins+in+eukaryotes:+targeting+a+ubiquitin+ligase+to+SUMOylated+proteins.">Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins.</a> EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).</li><li>Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+of+CoREST1+to+SUMO-2/3+contributes+to+gene-specific+repression+by+the+LSD1/CoREST1/HDAC+complex.">Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex.</a> Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).</li><li>Lyst, M. J., Stancheva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+SUMO+modification+in+transcriptional+repression+and+activation.">A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation.</a> Biochem Soc Trans. 35, 1389-1392 (2007).</li><li>Liu, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modification+by+SUMO-1+stimulates+the+promoters+of+translation+machinery+genes.">Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes.</a> Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).</li><li>Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+functions+in+constitutive+transcription+and+during+activation+of+inducible+genes+in+yeast.">SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast.</a> Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).</li><li>Chang, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+modification+by+SUMO-2/3+but+not+SUMO-1+prevents+the+epigenetic+activation+of+key+immune-related+genes+during+Kaposi's+sarcoma+associated+herpesvirus+reactivation.">The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi's sarcoma associated herpesvirus reactivation.</a> BMC Genomics. 14, 824 (2013).</li><li>Neyret-Kahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+at+chromatin+governs+coordinated+repression+of+a+transcriptional+program+essential+for+cell+growth+and+proliferation.">Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation.</a> Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).</li><li>Tatham, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+chains+of+SUMO-2+and+SUMO-3+are+conjugated+to+protein+substrates+by+SAE1/SAE2+and+Ubc9.">Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).</li><li>Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+manipulation+of+cellular+protein+conjugation+pathways:+The+SUMO+lesson.">Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson.</a> World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).</li><li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMO+pathway:+emerging+mechanisms+that+shape+specificity,+conjugation+and+recognition.">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li><li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1.">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li><li>Knipscheer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubc9+sumoylation+regulates+SUMO+target+discrimination.">Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination.</a> Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).</li><li>Vethantham, V., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+sumoylation+of+recombinant+proteins+and+subsequent+purification+for+use+in+enzymatic+assays.">In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).</li><li>Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+encodes+a+bZIP+protein+with+homology+to+BZLF1+of+Epstein-Barr+virus.">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus.</a> J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).</li><li>Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-bZIP+Mediated+SUMO-2/3+Specific+Modification+on+the+KSHV+Genome+Negatively+Regulates+Lytic+Gene+Expression+and+Viral+Reactivation.">K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation.</a> PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).</li><li>Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RsrII--a+novel+restriction+endonuclease+with+a+heptanucleotide+recognition+site.">RsrII--a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site.</a> Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R-EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Gingold, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transformation.">Bacterial transformation.</a> Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).</li><li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone.">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+isolation+of+synaptic+vesicles+from+mammalian+brain.">Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain.</a> Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).</li></ol>

著者は潜在的な利益相反を開示ないです。

プロトコルは生体外でsumo 化ここで説明は日常的に識別された Ubc9 基板の sumo 化地位を確立する使用します。相撲 E3 リガーゼの sumo 化関数を勉強する標準プロトコルを使用して主要な制限は、相撲 E1 が活性化し、E2 抱合酵素 Ubc9の in vitroにおける相撲の活用を最大化する豊富です。このような課題を考慮して考えてレベルに相撲 E1 と E2 酵素の量を滴定 1 つはかろうじて sumo 化?...

SUMO 化当初、タンパク質安定性1を調整する可逆的な翻訳後修飾 (PTM) として同定されました。直接活用に加えて、相撲はできます相撲相互作用モチーフ (SIMs)2非共有結合性相互作用によってタンパク質に添付も。Src ホモロジー 2 (SH2) をかくまっている分子によってチロシン リン酸化のバインディングまたはホスホチロシン結合のよう (PTB) ドメイン3,4SUMO 化のための追加の対話プラットフォームを提供します選択SIM を含むエフェクター蛋白質5,6の募集。シグナル伝達の規制に加えて転写因子とクロマチン再構築分子の sumo 化は遺伝子発現7、8を調節するのに役立ちます。ゲノム sumo 化パターンの研究は、正9,10または負の10、11,12転写に関連付けられていることを明らかにしました。規制で一部の sumo 化のパラログの特異性のため。
タンパク質は、哺乳類細胞で現在の活用の 3 つの主要な相撲アイソ フォームがあります。相撲-1 と高い相同性相撲 2 相撲 3 (相撲-2/3 と呼ばれる)13が含まれます。相撲は通常ターゲット蛋白質の ψKxD/E コンセンサス モチーフ内リジン (K) 残基に共役系します。相撲 E3 リガーゼの SIM はパラログ特異性14担当です。ユビキチン経路 E3 リガーゼの数百人を含むと対照をなして、いくつか相撲 E3 リガーゼ特定15するされているだけ。相撲 E3 リガーゼは、(i) Ubc9 のバインド、(ii) SIM ドメインを介して相撲部をバインドして (iii) 基板上に Ubc9 から相撲伝達を強化する能力を含むプロパティによって定義されます。E3 リガーゼは相撲活用16、絶対に必要ではないが、基板と相撲パラログの特異性を提供します。通常以来総基質タンパク質のごく一部は相撲変更だけ SUMOylated 蛋白質の生体内での検出は常に挑戦です。したがって、正確かつ再現可能なアッセイは、SUMO 化の正確な機能を解明するために必要です。
体外基質タンパク質の sumo 化を触媒する精製 Ubc9 の能力を評価、sumo 化の試金は相撲変更17を勉強するための広く受け入れられた試金。ただし、ほとんどの場合相撲 E3 リガーゼ活性を検出できないまたはできますのみによって検出される変異相撲リガーゼと高相撲 E3 リガーゼ活性と低基質特異性標準プロトコル Ubc918の豊富な量が存在するので.この試金の全体的な成功は主として精製 Ubc9 の慎重な滴定によって異なります。ここで説明した生体外でsumo 化アッセイが標準の sumo 化から変更されたプロトコル (材料の表を参照してください)。カポジ肉腫関連ヘルペス ウイルス (KSHV) の再アクティブ化の間に高められたグローバル SUMO 化の観察を求め私たちは sumo 化規制上の責任がありますウイルス相撲 E3 リガーゼを識別します。次のウイルスの相撲 E3 リガーゼ K bZIP の相互作用の蛋白質の小規模上映、p53 は新規基質として同定されました。このプロトコルでは昆虫細胞発現と野生型 K bZIP、相撲-2/3 の特異性を持つウイルス相撲 E3 リガーゼの精製の手順で詳細に紹介します。P53、よく知られている相撲の基質の sumo 化を高める精製 K bzip 型の機能は、E1 と E2 酵素の減らされた量の存在下で評価されます。この変更された sumo 化の試金を使用して、研究者確実に定義できます相撲 E3 リガーゼの能力 SUMOylate 小説または知られている基板に sumo 化における主要なステップであります。また、このメソッド低リガーゼ活性が高い基質特異性を持つ新規相撲 E3 リガーゼを識別に役立ちます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:853px;" width="854">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">pFastBac</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10359-016</td>
			<td style="width:219px;">dual expression baculovirus vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCR2.1-TOPO vector</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR product vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">competent cell&#160; E. coli DH5&#945;</td>
			<td style="width:153px;">Yeastern Biotech</td>
			<td style="width:119px;">FYE678-80VL</td>
			<td>competent E. coli cells A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">E. coli DH10Bac</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10359-016</td>
			<td>competent E. coli cells B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04709705001</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985062</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">T4 Ligase</td>
			<td style="width:153px;">NEW England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">CpoI (RsrII)</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Bluo-gal</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B1690</td>
			<td>galactosidase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">IPTG</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Grace&#8217;s Insect Medium</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11605094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9393-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">K0254-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">gentamicin</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">tetracyclin</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">LB Broth</td>
			<td style="width:153px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">HEPES</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4034-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">NaCl</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9888-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">KCl</td>
			<td style="width:153px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5136-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:153px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">3246-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:153px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">1.13760.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">TRIS (Base)</td>
			<td style="width:153px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Non-fat milk</td>
			<td style="width:153px;">Fonterra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">glycerol</td>
			<td style="width:153px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">2136-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:153px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0694-1L</td>
			<td>detergent A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Tween 20</td>
			<td style="width:153px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0777-500ML</td>
			<td>detergent B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Poloxamer 188 solution</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5556-100ML</td>
			<td>detergent C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04 693 132 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">3x Flag peptide</td>
			<td style="width:153px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">anti-FLAG m2 Magnetic beads</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8823</td>
			<td>antibody-tagged magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">SUMOlink SUMO-1 Kit</td>
			<td style="width:153px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">40120</td>
			<td>standard SUMOylation protocol&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">SUMOlink SUMO-2/3 Kit</td>
			<td style="width:153px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">40220</td>
			<td>standard SUMOylation protocol&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:153px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">QIAGEN Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:153px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">12123</td>
			<td>plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Polypropylene tubes</td>
			<td style="width:153px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:153px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:153px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">CNG3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Loading tip</td>
			<td style="width:153px;">Sorenson BioScience</td>
			<td style="width:119px;">28480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">PVDF</td>
			<td style="width:153px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEF1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Blotting filter paper</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1703932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell)</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1658001 EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1703940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Pierce ECL Western Blotting</td>
			<td style="width:153px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td>ECL reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">suspension mixer</td>
			<td style="width:153px;">Digisystem laboratory instruments&#160; Inc.</td>
			<td style="width:119px;">SM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaker</td>
			<td>Kansin instruments Co.</td>
			<td>OS701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">ImageQuant LAS 4000 
			biomolecular imager</td>
			<td style="width:153px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28955810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Sf9</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td>B82501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">anti-p53 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">anti-rabbit antibody</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro sumoylation assay to study sumo e3 ligase activity

小さなユビキチン様修飾 (相撲) の変更は、重要な翻訳後修飾 (PTM) 主に蛋白質蛋白質の相互作用を変調を介するシグナル伝達を仲介します。ユビキチンの変更と同様に、sumo 化は E1 活性化酵素 (SAE1/SAE2)、E2 抱合 (Ubc9) E3 リガーゼ (すなわちPIA の家族、RanBP2、Pc2) など順次酵素カスケードによって監督されます。しかし、ユビキチン化とは異なる、E3 リガーゼは非本質的なため反応が相撲の活用の精度と有効性を提供します。タンパク質の sumo 化によって変更は、基質特異的抗体と相撲特異抗体と免疫ブロット免疫沈降法による生体内での試金によって識別できます。ただし、タンパク質 SUMO E3 リガーゼ活性のデモ sumo 化アッセイ精製酵素、基質、および相撲蛋白質を使用しての体外の再構成が必要です。In vitro反応で通常 SAE1/SAE2 と Ubc9 だけなので相撲の活用のために十分、sumo 化と推定される E3 リガーゼによる強化が検出する容易で常にはないです。ここで、変更された生体外の in vitro再構成システムを用いた SUMO 化を一貫して識別する sumo 化プロトコルについて述べる.触媒活性 K bZIP、ウイルス相撲-2/3 E3 リガーゼを浄化するためにステップバイ ステップのプロトコルについて述べる。精製 K bZIP の sumo 化活動は、p53、相撲の既知のターゲットに表示されます。このプロトコルないしか採用できない小説相撲 E3 リガーゼの解明その相撲パラログ遺伝子の特異性を明らかにするためにも。

製造元によって提供される情報によると sumo 化アッセイで E1 と E2 酵素の標準量は 50 nM と 500 nM、それぞれ。E2 の最小量は酵素 Ubc9 p53 SUMOylate することができるの活用はだった最初の in vitro sumo 化アッセイによって決まります。低 Ubc9 標準、体外sumo 化の試金のプロトコルで使用される量の 5 分の 1 SUMOylate p53 効率的にすることができた (図 ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity at JoVE.com

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

ユビキチンリ ガーゼとは異なりいくつかの相撲 E3 リガーゼが同定されています。この変更された体外sumo 化プロトコルの in vitro再構成法による新規相撲 E3 リガーゼを識別することです。

体外相撲 E3 リガーゼ活性を研究する sumo 化アッセイ

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

in-vitro-sumoylation-assay-to-study-sumo-e3-ligase-activity

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

9.3K ビュー.  National Yang-Ming University. ユビキチンリ ガーゼとは異なりいくつかの相撲 E3 リガーゼが同定されています。この変更された体外sumo 化プロトコルの in vitro再構成法による新規相撲 E3 リガーゼを識別することです。

ビデオ: In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

生物学

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

アン試験管内でフルオロブロックの腫瘍の浸潤アッセイ

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

LRRK2のキナーゼ活性を測定する in vitroで</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

凍結保存サンプルの回復のための日曜大工のデバイスが誤って低温貯蔵タンクに落とし

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ<em&gt;体外</em&gt;血管新生に関する研究

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

タンパク質アルギニンメチル化を研究するためのin vitroでメチル化アッセイで

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

インビトロアッセイではホスファチジルメチルトランスフェラーゼ活性を測定します

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate energy for mechanical work, such as protein trafficking and degradation, solute transport, and cellular movements. The protocol described here is a basic assay for measuring the in vitro activity of purified ATPases for functional characterization. Proteins hydrolyze ATP in a reaction that results in inorganic phosphate release, and the amount of phosphate liberated is then quantitated using a colorimetric assay. This highly adaptable protocol can be adjusted to measure ATPase activity in kinetic or endpoint assays. A representative protocol is provided here based on the activity and requirements of EpsE, the AAA+ ATPase involved in Type II Secretion in the bacterium Vibrio cholerae. The amount of purified protein needed to measure activity, length of the assay and the timing and number of sampling intervals, buffer and salt composition, temperature, co-factors, stimulants (if any), etc. may vary from those described here, and thus some optimization may be necessary. This protocol provides a basic framework for characterizing ATPases and can be performed quickly and easily adjusted as necessary.

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

計測<em&gt;インビトロ</em酵素特性評価のための&gt; ATPase活性

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, small ubiquitin-related modifier (SUMO) is a ubiquitin-like protein that is covalently attached to the lysine residues of a variety of target proteins to regulate cellular processes, such as gene transcription, DNA repair, protein interaction and degradation, subcellular transport, and signal transduction. The most common approach to detecting protein SUMOylation is based on the expression and purification of recombinant tagged proteins in bacteria, allowing for an in vitro biochemical reaction which is simple and suitable for addressing mechanistic questions. However, due to the complexity of the process of SUMOylation in vivo, it is more challenging to detect and analyze protein SUMOylation in cells, especially when under endogenous conditions. A recent study by the authors of this paper revealed that endogenous retinoblastoma (Rb) protein, a tumor suppressor that is vital to the negative regulation of the cell cycle progression, is specifically SUMOylated at the early G1 phase. This paper describes a protocol for the detection and analysis of Rb SUMOylation under both endogenous and exogenous conditions in human cells. This protocol is appropriate for the phenotypical and functional investigation of the SUMO-modification of Rb, as well as many other SUMO-targeted proteins, in human cells.

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Small ubiquitin-related modifier (SUMO) family proteins are conjugated to the lysine residues of target proteins to regulate various cellular processes. This paper describes a protocol for the detection of retinoblastoma (Rb) protein SUMOylation under endogenous and exogenous conditions in human cells.

生体内でRb タンパク質 sumo 化ひと細胞の検出と解析

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the prediction of family functions based on several features, such as the presence of sequence motifs or of particular sites for post-translational modification and the expression profile of family members in different conditions. This work describes a detailed protocol for gene family characterization. Here, the procedure is applied to the characterization of the Arabidopsis T&#243;xicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitin ligase family in grapevine. The methods include the genome-wide identification of family members, the characterization of gene localization, structure, and duplication, the analysis of conserved protein motifs, the prediction of protein localization and phosphorylation sites as well as gene expression profiling across the family in different datasets. Such procedure, which could be extended to further analyses depending on experimental purposes, could be applied to any gene family in any plant species for which genomic data are available, and it provides valuable information to identify interesting candidates for functional studies, giving insights into the molecular mechanisms of plant adaptation to their environment.

This article describes the procedure for the identification and characterization of a gene family in grapevine applied to the family of Arabidopsis T&#243;xicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitin ligases.

ゲノムワイドな探索とグレープバインで ATL E3 ユビキチンリ ガーゼ遺伝子家族の表現メタ分析のための包括的なワークフロー

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...