Name: in vitro sumoylation assay to study sumo e3 ligase activity
Uploaded: 2018-01-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
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この作品は、省の科学と技術 (PCC にほとんど、105-2320-B-010-007-MY3)、国立衛生研究所 (NHRI - PCC に EX105-10215BC)、科学技術 (最も 105-2314-B-400-019 省からの助成金によって支えられました。HJK) して国立衛生研究所 (NHRI MG-105-SP-10、HJK に NHRI の MG-106 SP-10) から。この作品も、PCC に原稿出版物の国立陽明大学と部分的サポートされていました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の賠償の役割はなかった。

1. バキュロ ウイルス発現コンストラクトの調製
<ol><li>
相撲 E3 リガーゼ K bZIP 浄化デュアル式バキュロウイルスベクターへ K bZIP19の cDNA のクローニング (材料表参照) N 末端エピトープ タグ付き。(ベクトル-タグ-K-bZIP としてプロトコルを通して示される) オクタペプチド タグを使用して成功を収めています。 注: K bZIP ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) のクローニングのための DNA のテンプレートは cDNA の逆ドキシサイクリン治療20TREx F3H3 K-Rta BCBL 1 細胞由来 RNA から転写です。<ol>
<li>サイトのクローンを作成私Cpoとデュアル発現ベクターにフルレングスの K bZIP cDNA19を転送します。Cpo私は PCR の製品や 3 h2137 ° C でデュアル発現ベクターの 1 μ g を消化します。</li>
		<li>分離・220.8% の agarose のゲルの電気泳動、次消化の DNA を抽出します。挿入 (K bZIP) を縛るし、製造元の指示に従って 30 分の 16 ° C T4 DNA リガーゼによるベクトル (材料の表を参照してください)。</li>
		<li>5 μ L を追加 50 μ L に結紮 DNA の有能なエシェリヒア属大腸菌細胞」(参照材料表) 1.5 mL チューブ。30 分間氷の上に置きます。45 42 ° C の水浴に 1.5 mL チューブをインキュベーションして、s およびすぐにチューブを入れて 3 分間氷の上。</li>
		<li>チューブに 600 μ L まで媒体 (0.5% (w/v) 酵母エキス、2% (w/v) トリプトン、10 mM の NaCl、2.5 mM KCl、20 mM MgSO4、および 4% (w/v) グルコース) を追加し、37 ° C 1 時間インキュベートします。その後、600 x g で 3 分間室温でチューブを遠心分離機します。</li>
		<li>上清を除去、60 μ ルリア ベルターニカミラ培地でペレットを再懸濁します (LB; 1% (w/v) トリプトン 0.5% (w/v) 酵母エキス、85 mM の NaCl) と 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB 寒天培地プレート上に広がる。16 h23,2437 ° C で寒天版を孵化させなさい。</li>
		<li>1 植民地揺れ 250 rpm で 100 μ g/mL アンピシリンと 16 h の 37 ° C で培養を含む 5 mL の LB 培地に接種するを選択します。その後、製造元の指示に従ってプラスミド抽出キットによってベクトル タグ K bZIP プラスミドを抽出 (材料の表を参照してください)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ベクトル タグ K bZIP の有能なエシェリヒア属大腸菌への変換によってタグ K bZIP をかくまっている組換えバクミドを生成する細胞"B"(材料の表を参照してください)。
	<ol>
<li>0.2 μ g ベクター-タグ-K-bZIP プラスミドと 100 μ L を混在させる有能なe.大腸菌細胞"B"1.5 mL チューブと置かれた氷 30 分インキュベート 45 42 ° C の水浴中管 s およびすぐにチューブを入れて 3 分間氷の上。</li>
		<li>チューブにまで中の 900 μ l 添加し 50 rpm で回転と 4 h の 37 ° C で孵化させなさい。次に、媒体の 10 μ L を取る、50 μ G/ml カナマイシン、7 μ g/mL ゲンタマイシン、10 μ G/ml テトラサイクリン、100 μ g/mL ガラクトシダーゼの基質、40 μ g/mL イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG を含有 LB 寒天培地プレート上を広めるための S.O.C メディアの追加の 50 μ L を追加)、37 ° C で 48 h 用の版を孵化させなさいと</li>
		<li>50 μ G/ml カナマイシン、7 μ g/mL ゲンタマイシン 10 μ G/ml テトラサイクリンを含む 5 mL の LB 培地の白いコロニーを接種します。250 rpm の 16 h の揺れは、37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>タグ K bZIP をかくまっている DNA の組換えのバクミドを分離、定量化、および再濃度 1 μ g/μ L25で中断します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
組換えバクミド 6 ウェル プレートのウェル 1 個で Sf9 細胞にタグ K bZIP を含んでいる DNA の 1 μ g を株でタグ K bZIP を表現する組換えバキュロを生成します。
	<ol>
<li>10% 牛胎児血清 (FBS) とそれぞれ 1% ゲンタマイシン 2 mL グレースの昆虫中種子 2 x 106 Sf9 細胞 (材料の表を参照してください) 6 ウェル プレートのよくし、27 ° C 1 時間インキュベートします。</li>
		<li>Sf9 細胞 10 %fbs、ゲンタマイシン 1%、1% 洗剤 C 付属グレースの昆虫中のログ相培養を維持 (材料の表を参照) で 140 rpm で軌道懸濁液 27 ° C。検定とトリパン ブルー染色; を使用してセルをカウントします。細胞生存率は、95% を超える必要があります。継代培養の比が 1:3 すべての 2-3 日 (最小密度 ~0.5 x 106セル/mL) を使用してセルを維持します。</li>
		<li>2 μ L バクミド DNA を追加 (1 μ g/μ L) と 98 μ L は、2 mL チューブに血清メディア (材料の表を参照) を削減します。4 μ L のトランスフェクション試薬を加えます (材料表参照) チューブとよく混ぜる。15 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>各ウェルにこのトランスフェクション混合物 (104 μ L) を追加し、27 ° C 12-16 時間インキュベートします。</li>
		<li>穏やかな吸引と排出されるメディアを削除し、10 %fbs と 1% ゲンタマイシンに付属している新鮮な恵みの昆虫培地 2 mL に置き換えます。Sf9 細胞プレート表面に緩く付着し、穏やかな吸引を邪魔されません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
トランスフェクション後組換えバキュロ ウイルスを収集し、さらに実験のための高力価の在庫 (P1) を取得するバキュロ ウイルスを増幅します。
	<ol>
<li>無菌細胞リフターを使用してこすり、Sf9 細胞媒体を変更した後 72 時間は、1.5 mL チューブと 10 の渦でそれぞれ個々 の井戸から上清を収集 s。</li>
		<li>150 x g に 3 分の 4 ° C で遠心分離機の P0 バキュロ ウイルスと 1.5 mL チューブ (各管に 1 mL バキュロ ウイルス) の因数として上澄み。-80 ° C でストア</li>
		<li>10 mL グレースの昆虫中種子 1 x 107 Sf9 細胞 10 %fbs と 1% ゲンタマイシン 10 cm シャーレで付属し、27 ° C 1 時間で孵化させなさい。</li>
		<li>組換えバキュロ発現タグ-K bzip 型の増幅、シード Sf9 細胞に 0.5 mL P0 バキュロ ウイルスを追加し、, 48 h の 27 ° C で。</li>
		<li>1 ヶ月 15 mL チューブと 4 ° C でストアで P1 バキュロ ウイルス上清を収集します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. K bZIP の浄化
<ol><li>1.3.2 の手順の説明に従って 10 %fbs、ゲンタマイシン 1%、1% 洗剤 C 140 rpm で軌道懸濁液中の 27 ° c に付属しているグレースの昆虫中 Sf9 細胞のログ相培養を維持します。</li>
	<li>伝達の日、2 x 106セル/ml の密度と Sf9 細胞の 250 mL にバキュロ ウイルスを含む上清 (P1) の 1 つの mL を追加します。</li>
	<li>揺れ、140 rpm と軌道シェーカーで 27 ° C、72 時間 Sf9 細胞を孵化し、4 ° C で 15 分間 2,740 × g で遠心分離によって収集</li>
	<li>上清を除去し、10 mL の溶解バッファー (20 mM HEPES pH 7.9, 0.5 M の NaCl、1% 洗剤 (材料の表を参照)、2% グリセロール、プロテアーゼ阻害剤のカクテル) 細胞ペレットを溶解、4 ° C で 30 分間懸濁液ミキサーを使用して 50 rpm で回転。</li>
	<li>遠心分離機にて細胞培養上清を収集するために 15 分間 15,000 × g。</li>
	<li>タグ K bZIP を浄化するために 14 mL ポリプロピレン チューブに抗体タグ磁気ビーズの 50 μ L と細胞溶解液 (10 mL) を孵化し、懸濁液ミキサーを使用しての 4 ° C で 3 時間 50 rpm で回転します。30 g 遠心 x 800 でビーズをペレット蛋白質のキャプチャ、次 4 ° C で s上澄みのほとんどを取り外し、再度約 1 mL、残気量のビーズを中断、洗濯用 1.5 mL チューブに。</li>
	<li>マグネット スタンドにビーズを含むチューブを配置することによってキャプチャされたタンパク質を洗浄し、磁気ビーズが完全に管の側に付着した後、上澄みを除去します。</li>
	<li>
換散バッファーのビード 4 回洗浄しなさい。
	<ol>
<li>1.5 mL チューブに 1 mL の溶解バッファーを追加し、10 回チューブを反転します。マグネット スタンドに 1.5 mL チューブを置き、2.7 で説明されているように、上清を除去します。</li>
		<li>別の 3 回前の手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でビーズを一度洗ってください。
	<ol>
<li>1.5 mL チューブに 1 mL の PBS (137 mM NaCl、KCl、2.7 mM 8 mM Na2HPO4、1.5 mM KH2PO4) を追加し、10 回チューブを反転します。</li>
		<li>マグネット スタンドに 1.5 mL チューブを入れ、上澄みを取り外します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 mL チューブに PBS で希釈した 150 μ g/mL オクタペプチドの 100 μ L を追加することによって磁気ビーズの抗体タグからタグ K bZIP 蛋白質を溶出します。室温で懸濁液ミキサーで 50 rpm で 10 分間のチューブを回転させます。マグネット スタンドにチューブを配置し、きれいな 1.5 mL チューブに K bZIP 含む上清を収集します。</li>
	<li>SDS-PAGE ブルー26を染色の順で 1-5 μ L の精製タグ K bZIP 蛋白質を分析します。負荷 2 μ、1 μ g と同じウシ血清アルブミン (BSA) の 0.5 μ g のサンプルはゲルし ImageJ のような画像処理プログラムと定量化のためにそれを使用します。BSA の標準に比較して K bZIP 濃度を推定します。</li>
	<li>精製 K bZIP は、各 sumo 化アッセイに使用する準備が整いました。PBS で K bZIP を 100 ng/μ L と小さい因数-80 ° C でストアの最終濃度に希釈します。</li>
</ol>3. sumo 化アッセイ
<ol><li>各体外sumo 化反応のマスターの組合せに精製タグ K bzip 型の 100 ng/μ L の 3 μ L を追加します。マスター ミックスのコンポーネントを含む 1 μ L 蛋白質バッファー、sumo 化バッファー、0.5 μ L p53 蛋白 (0.5 mg/mL)、25 x 1 活性化酵素 E1 の nM (ストック濃度: 1 μ M), 50 nM E2 の酵素の活用 (ストック濃度: 10 μ M)、および 250 相撲ペプチド (相撲 1 の各 nM、相撲-2、または相撲-3;ストック濃度: 5 μ M) 17 μ L の最終巻に。</li>
	<li>軽く内容をミックスし、3 h は SDS ページの読み込みバッファー x 2 の 20 μ L の追加によって反作用を停止するため、30 ° C で反応を孵化させなさい (100 mM トリス塩酸 pH 6.8, ドデシル硫酸ナトリウム 4%、0.2% (w/v) ブロモフェノールの青、20% (v/v) グリセロール、200 mM β-メルカプトエタノール) と95 ° C、5 分でサンプルを変化させなさい。</li>
	<li>
SDS-PAGE のサンプルを分離、半乾燥電気泳動転送装置を使用して PVDF 膜に分けられた蛋白質を転送および抗 p53 抗体を用いたウエスタンブロット分析します。
	<ol>
<li>2.11、ステップのようにゲル装置を設定し、ゲルの井戸に 20 μ L のサンプルを読み込みます。</li>
		<li>(色素のバンドに達するゲルの底) まで約 120 分 80 V で電流定数 10% ゲルを実行します。電気泳動の終了後、電源をオフにします。</li>
		<li>ゲル装置、ゲル、ゲルを取るカセットを外し 5 分半乾燥の転送バッファー (48 mM トリス-HCl、39 mM グリシン、20% メタノール) にゲルをフロートします。</li>
		<li>別のコンテナーを取り出して 1 分のメタノールに PVDF 膜を浸漬します。メタノールの PVDF を取るし、半乾燥の転送バッファーに配置します。5 分間膜を振ちましょう。</li>
		<li>半乾燥電気泳動装置の安全カバーを取り外します。</li>
		<li>事前フィルター ペーパーをウェットし、準備下白金アノードにゲル サンドイッチを次のように: ろ紙、PVDF 膜、ゲル、及びフィルター ペーパー。</li>
		<li>、電源を 15 V 定数 90 分ターン現在でしみを実行して、安全な陰極板と安全カバーは、セミドライ装置を外し、PVDF 膜を取る。</li>
		<li>バッファーを妨げるブロック PVDF 膜 (TBST バッファーで 5%、無脂肪ミルク (137 mM NaCl2、20 mM トリス-HCl、0.1% 洗剤 B (材料の表を参照)、pH 7.6)) 軌道シェーカーで振って 30 rpm で 1 時間室温で。</li>
		<li>30 rpm 振動懸濁液ミキサーを使用して抗 p53 抗体希釈 (1:1, 000) 4 ° C で 12-16 h のブロック バッファーで PVDF 膜を交配させます。</li>
		<li>コンテナーに PVDF 膜を取り出し、TBST で置きます。Tbst 倍 PVDF 膜を洗い流してください。</li>
		<li>軌道シェーカーで振って 45 rpm で 30 分間 TBST で PVDF 膜を浸します。</li>
		<li>30 rpm サスペンション ミキサーを使用して振動を室温で 1 時間ブロッキング バッファーで抗家兎抗体希釈西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) と共役 (1:4, 000) PVDF 膜を交配させます。</li>
		<li>TBST 3 回手順 3.4.10 PVDF 膜を洗浄します。</li>
		<li>45 rpm は、懸濁液ミキサーを使用して振動 TBST で 30 分間の PVDF 膜を浸します。TBST を削除し、12 h まで 4 ° C で PVDF 膜を維持するために PBS を追加します。</li>
		<li>1 と 2 (1:1) (材料の表を参照してください) の化学発光基質 (ECL 基板) 試薬を混ぜます。PBS から PVDF 膜を削除、紙タオルや余分な水分を吸収し、簡単にしみが付くことで 3 ~ 5 分削除過剰な ECL 試薬の各膜の表面に ECL 試薬の 400 μ L を直ちに追加する軽型ワイパーで簡単にしみが、m を許可しません。embrane に完全に乾燥。</li>
		<li>オートラジオグラフィー フィルム27発光イメージング システムを使用してしみを公開します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bies, J., Markus, J., Wolff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+attachment+of+the+SUMO-1+protein+to+the+negative+regulatory+domain+of+the+c-Myb+transcription+factor+modifies+its+stability+and+transactivation+capacity.">Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity.</a> J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).</li><li>Lin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SUMO-interacting+motif+in+Daxx+SUMO+modification,+subnuclear+localization,+and+repression+of+sumoylated+transcription+factors.">Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors.</a> Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).</li><li>Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+Src+Homology-2+domain+containing+protein+B+(SHB)+in+beta+cells.">The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells.</a> J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).</li><li>Huang, W. 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著者は潜在的な利益相反を開示ないです。

プロトコルは生体外でsumo 化ここで説明は日常的に識別された Ubc9 基板の sumo 化地位を確立する使用します。相撲 E3 リガーゼの sumo 化関数を勉強する標準プロトコルを使用して主要な制限は、相撲 E1 が活性化し、E2 抱合酵素 Ubc9の in vitroにおける相撲の活用を最大化する豊富です。このような課題を考慮して考えてレベルに相撲 E1 と E2 酵素の量を滴定 1 つはかろうじて sumo 化?...

SUMO 化当初、タンパク質安定性1を調整する可逆的な翻訳後修飾 (PTM) として同定されました。直接活用に加えて、相撲はできます相撲相互作用モチーフ (SIMs)2非共有結合性相互作用によってタンパク質に添付も。Src ホモロジー 2 (SH2) をかくまっている分子によってチロシン リン酸化のバインディングまたはホスホチロシン結合のよう (PTB) ドメイン3,4SUMO 化のための追加の対話プラットフォームを提供します選択SIM を含むエフェクター蛋白質5,6の募集。シグナル伝達の規制に加えて転写因子とクロマチン再構築分子の sumo 化は遺伝子発現7、8を調節するのに役立ちます。ゲノム sumo 化パターンの研究は、正9,10または負の10、11,12転写に関連付けられていることを明らかにしました。規制で一部の sumo 化のパラログの特異性のため。
タンパク質は、哺乳類細胞で現在の活用の 3 つの主要な相撲アイソ フォームがあります。相撲-1 と高い相同性相撲 2 相撲 3 (相撲-2/3 と呼ばれる)13が含まれます。相撲は通常ターゲット蛋白質の ψKxD/E コンセンサス モチーフ内リジン (K) 残基に共役系します。相撲 E3 リガーゼの SIM はパラログ特異性14担当です。ユビキチン経路 E3 リガーゼの数百人を含むと対照をなして、いくつか相撲 E3 リガーゼ特定15するされているだけ。相撲 E3 リガーゼは、(i) Ubc9 のバインド、(ii) SIM ドメインを介して相撲部をバインドして (iii) 基板上に Ubc9 から相撲伝達を強化する能力を含むプロパティによって定義されます。E3 リガーゼは相撲活用16、絶対に必要ではないが、基板と相撲パラログの特異性を提供します。通常以来総基質タンパク質のごく一部は相撲変更だけ SUMOylated 蛋白質の生体内での検出は常に挑戦です。したがって、正確かつ再現可能なアッセイは、SUMO 化の正確な機能を解明するために必要です。
体外基質タンパク質の sumo 化を触媒する精製 Ubc9 の能力を評価、sumo 化の試金は相撲変更17を勉強するための広く受け入れられた試金。ただし、ほとんどの場合相撲 E3 リガーゼ活性を検出できないまたはできますのみによって検出される変異相撲リガーゼと高相撲 E3 リガーゼ活性と低基質特異性標準プロトコル Ubc918の豊富な量が存在するので.この試金の全体的な成功は主として精製 Ubc9 の慎重な滴定によって異なります。ここで説明した生体外でsumo 化アッセイが標準の sumo 化から変更されたプロトコル (材料の表を参照してください)。カポジ肉腫関連ヘルペス ウイルス (KSHV) の再アクティブ化の間に高められたグローバル SUMO 化の観察を求め私たちは sumo 化規制上の責任がありますウイルス相撲 E3 リガーゼを識別します。次のウイルスの相撲 E3 リガーゼ K bZIP の相互作用の蛋白質の小規模上映、p53 は新規基質として同定されました。このプロトコルでは昆虫細胞発現と野生型 K bZIP、相撲-2/3 の特異性を持つウイルス相撲 E3 リガーゼの精製の手順で詳細に紹介します。P53、よく知られている相撲の基質の sumo 化を高める精製 K bzip 型の機能は、E1 と E2 酵素の減らされた量の存在下で評価されます。この変更された sumo 化の試金を使用して、研究者確実に定義できます相撲 E3 リガーゼの能力 SUMOylate 小説または知られている基板に sumo 化における主要なステップであります。また、このメソッド低リガーゼ活性が高い基質特異性を持つ新規相撲 E3 リガーゼを識別に役立ちます。

<table><tbody><tr><td>pFastBac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>dual expression baculovirus vector</td></tr><tr><td>pCR2.1-TOPO vector</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>PCR product vector</td></tr><tr><td>competent cell&amp;nbsp; E. coli DH5&amp;alpha;</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYE678-80VL</td><td>competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; cells A</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; cells B</td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Roche</td><td>04709705001</td><td>transfection reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>reduced serum media</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>NEW England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>CpoI (RsrII)</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0741</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1690</td><td>galactosidase substrate</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;s Insect Medium</td><td>Gibco</td><td>11605094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0254-20ML</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>tetracyclin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Merk</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merk</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>sodium dodecyl sulfate</td><td>Merk</td><td>1.13760.1000</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (Base)</td><td>J.T.Baker</td><td>4109-06</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat milk</td><td>Fonterra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>J.T.Baker</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td>detergent A</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-500ML</td><td>detergent B</td></tr><tr><td>Poloxamer 188 solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556-100ML</td><td>detergent C</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>3x Flag peptide</td><td>Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG m2 Magnetic beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8823</td><td>antibody-tagged magnetic beads</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-1 Kit</td><td>Active Motif</td><td>40120</td><td>standard SUMOylation protocol&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-2/3 Kit</td><td>Active Motif</td><td>40220</td><td>standard SUMOylation protocol&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12123</td><td>plasmid extraction kit</td></tr><tr><td>Polypropylene tubes</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Corning</td><td>CNG3008</td><td></td></tr><tr><td>Loading tip</td><td>Sorenson BioScience</td><td>28480</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF1002</td><td></td></tr><tr><td>Blotting filter paper</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001 EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting</td><td>Thermo</td><td>32106</td><td>ECL reagent</td></tr><tr><td>suspension mixer</td><td>Digisystem laboratory instruments&amp;nbsp; Inc.</td><td>SM-3000</td><td></td></tr><tr><td>orbital shaker</td><td>Kansin instruments Co.</td><td>OS701</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000&lt;br/&gt; biomolecular imager</td><td>GE Healthcare</td><td>28955810</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>Thermo Scientific</td><td>B82501</td><td></td></tr><tr><td>anti-p53 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>#9282</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit antibody</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro sumoylation assay to study sumo e3 ligase activity

小さなユビキチン様修飾 (相撲) の変更は、重要な翻訳後修飾 (PTM) 主に蛋白質蛋白質の相互作用を変調を介するシグナル伝達を仲介します。ユビキチンの変更と同様に、sumo 化は E1 活性化酵素 (SAE1/SAE2)、E2 抱合 (Ubc9) E3 リガーゼ (すなわちPIA の家族、RanBP2、Pc2) など順次酵素カスケードによって監督されます。しかし、ユビキチン化とは異なる、E3 リガーゼは非本質的なため反応が相撲の活用の精度と有効性を提供します。タンパク質の sumo 化によって変更は、基質特異的抗体と相撲特異抗体と免疫ブロット免疫沈降法による生体内での試金によって識別できます。ただし、タンパク質 SUMO E3 リガーゼ活性のデモ sumo 化アッセイ精製酵素、基質、および相撲蛋白質を使用しての体外の再構成が必要です。In vitro反応で通常 SAE1/SAE2 と Ubc9 だけなので相撲の活用のために十分、sumo 化と推定される E3 リガーゼによる強化が検出する容易で常にはないです。ここで、変更された生体外の in vitro再構成システムを用いた SUMO 化を一貫して識別する sumo 化プロトコルについて述べる.触媒活性 K bZIP、ウイルス相撲-2/3 E3 リガーゼを浄化するためにステップバイ ステップのプロトコルについて述べる。精製 K bZIP の sumo 化活動は、p53、相撲の既知のターゲットに表示されます。このプロトコルないしか採用できない小説相撲 E3 リガーゼの解明その相撲パラログ遺伝子の特異性を明らかにするためにも。

製造元によって提供される情報によると sumo 化アッセイで E1 と E2 酵素の標準量は 50 nM と 500 nM、それぞれ。E2 の最小量は酵素 Ubc9 p53 SUMOylate することができるの活用はだった最初の in vitro sumo 化アッセイによって決まります。低 Ubc9 標準、体外sumo 化の試金のプロトコルで使用される量の 5 分の 1 SUMOylate p53 効率的にすることができた (図 ...

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In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

ユビキチンリ ガーゼとは異なりいくつかの相撲 E3 リガーゼが同定されています。この変更された体外sumo 化プロトコルの in vitro再構成法による新規相撲 E3 リガーゼを識別することです。

体外相撲 E3 リガーゼ活性を研究する sumo 化アッセイ

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

9.3K ビュー.  National Yang-Ming University. ユビキチンリ ガーゼとは異なりいくつかの相撲 E3 リガーゼが同定されています。この変更された体外sumo 化プロトコルの in vitro再構成法による新規相撲 E3 リガーゼを識別することです。

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

生物学

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. This method utilizes a recombinant modified SUMO-trapping protein fragment, kmUTAG, derived from the Ulp1 SUMO protease of the stress-tolerant budding yeast Kluyveromyces marxianus. We have adapted the properties of the kmUTAG for the purpose of studying sumoylation in a variety of model systems without the use of antibodies. For the study of SUMO, KmUTAG has several advantages when compared to antibody-based approaches. This stress-tolerant SUMO-trapping reagent is produced recombinantly, it recognizes native SUMO isoforms from many species, and unlike commercially available antibodies it shows reduced affinity for free, unconjugated SUMO. Representative results shown here include the localization of SUMO conjugates in mammalian tissue culture cells and nematode oocytes.

SUMO is an essential and highly conserved, small ubiquitin-like modifier protein. In this protocol we are describing the use of a stress-tolerant recombinant SUMO-trapping protein (kmUTAG) to visualize native, untagged SUMO conjugates and their localization in a variety of cell types.

蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

生化学

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

肝癌における相撲プロテオームの濃縮、単離、同定、特性評価のためのツールとしての相撲結合エンティティ(SES)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, including cell survival, proliferation, and differentiation. It is a reversible process that consists of a covalent attachment of ubiquitin to the substrate through a cascade reaction of at least three different enzymes, composed of E1 (Ubiquitin-activation enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-ligase enzyme). The E3 complex plays an important role in substrate recognition and ubiquitylation. Here, a protocol is described to evaluate substrate ubiquitylation in mammalian cells using transient co-transfection of a plasmid encoding the selected substrate, an E3 ubiquitin ligase, and a tagged ubiquitin. Before lysis, the transfected cells are treated with the proteasome inhibitor MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) to avoid substrate proteasomal degradation. Furthermore, the cell extract is submitted to small-scale immunoprecipitation (IP) to purify the polyubiquitylated substrate for subsequent detection by western blotting (WB) using specific antibodies for ubiquitin tag. Hence, a consistent and uncomplicated protocol for ubiquitylation assay in mammalian cells is described to assist scientists in addressing ubiquitylation of specific substrates and E3 ubiquitin ligases.

We provide a detailed protocol for a ubiquitylation assay of a specific substrate and an E3 ubiquitin-ligase in mammalian cells. HEK293T cell lines were used for protein overexpression, the polyubiquitylated substrate was purified from cell lysates by immunoprecipitation, and resolved in SDS-PAGE. Immunoblotting was used to visualize this post-translational modification.

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

ユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化DNA-タンパク質架橋の測定

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

著者スポットライト:DNAタンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, small ubiquitin-related modifier (SUMO) is a ubiquitin-like protein that is covalently attached to the lysine residues of a variety of target proteins to regulate cellular processes, such as gene transcription, DNA repair, protein interaction and degradation, subcellular transport, and signal transduction. The most common approach to detecting protein SUMOylation is based on the expression and purification of recombinant tagged proteins in bacteria, allowing for an in vitro biochemical reaction which is simple and suitable for addressing mechanistic questions. However, due to the complexity of the process of SUMOylation in vivo, it is more challenging to detect and analyze protein SUMOylation in cells, especially when under endogenous conditions. A recent study by the authors of this paper revealed that endogenous retinoblastoma (Rb) protein, a tumor suppressor that is vital to the negative regulation of the cell cycle progression, is specifically SUMOylated at the early G1 phase. This paper describes a protocol for the detection and analysis of Rb SUMOylation under both endogenous and exogenous conditions in human cells. This protocol is appropriate for the phenotypical and functional investigation of the SUMO-modification of Rb, as well as many other SUMO-targeted proteins, in human cells.

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Small ubiquitin-related modifier (SUMO) family proteins are conjugated to the lysine residues of target proteins to regulate various cellular processes. This paper describes a protocol for the detection of retinoblastoma (Rb) protein SUMOylation under endogenous and exogenous conditions in human cells.

生体内でRb タンパク質 sumo 化ひと細胞の検出と解析

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

体外相撲 E3 リガーゼ活性を研究する sumo 化アッセイ

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トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化

肝癌における相撲プロテオームの濃縮、単離、同定、特性評価のためのツールとしての相撲結合エンティティ(SES)

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

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機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

生体内でRb タンパク質 sumo 化ひと細胞の検出と解析