TR-FRETベースのアッセイは、JAK/STATシグナル伝達経路の特異的および選択的モジュレーターのスクリーニングおよび薬理学的特徴付けのための新しい費用対効果の高いツールを提供します。この技術は、ウェスタンブロットやELISAなどの従来の方法よりもはるかに簡単で、迅速で、再現性があり、堅牢です。洗浄工程は不要で、試薬は1回の工程で添加されます。
このイムノアッセイプラットフォームは、特異的抗体が利用可能であれば、他の細胞シグナル伝達タンパク質に容易に適用することができる。再現性のあるアッセイを設計するには、適切な細胞培養方法を使用し、標準的な操作手順を確立する必要があります。さらに、細胞培養および処理条件を慎重に最適化する必要があります。
手順を実証するのは、私たちの研究室の科学者であるジュヌヴィエーヴ・シャテルです。まず、HeLaおよびA431細胞を、10%FBSを添加したDMEMを用いて、加湿された摂氏37度および5%二酸化炭素インキュベーター内で培養する。細胞が70〜80%のコンフルエントに達したら、それらをトリプシン処理し、継代するか、アッセイに使用する。
アッセイを実行するには、事前に最適化された密度で50マイクロリットルの細胞を適切な培養培地中の96ウェル組織培養処理プレートに分注し、次いでそれらを摂氏37度および5%二酸化炭素インキュベーター内で一晩インキュベートする。翌日、ポリプロピレン製96ウェルプレートの12ウェルにわたって無血清培地で化合物を段階的に希釈することによって、試験化合物の中間2倍および4倍希釈系列を調製する。細胞刺激のために、シミュレータを含む無血清培地を2倍の濃度で50マイクロリットル加え、室温または37度で予め最適化された時間の間、細胞をインキュベートする。
細胞阻害のために、阻害剤を含む無血清培地を4倍濃度で25マイクロリットル加え、室温または37度のいずれかで予め最適化された時間の間細胞をインキュベートし、次いで、刺激剤を含む無血清培地を4倍濃度で25マイクロリットル加え、予め最適化された時間にわたってインキュベートする。次に、細胞を溶解するために、1X補充溶解緩衝液を調製し、それにホスファターゼ阻害剤カクテルを加える。細胞培養培地を慎重に除去して廃棄した後、直ちに調製した1X添加溶解緩衝液50マイクロリットルを加え、適度な攪拌で振とう下で室温で30分間インキュベートする。
TR-FRET検出のために、1X検出バッファー中に4X抗体検出ミックスを調製し、次いでEUAB1およびFRAB2抗体溶液、ならびにEUAB3およびFRAB4抗体溶液を1X検出緩衝液に調製する。最後に、予め希釈されたEUAB1を、リンタンパク質の検出のために予め希釈されたFRAB2と、総タンパク質の検出のために予め希釈されたEUAB3および予め希釈されたFRAB4とを混合する。次いで、15マイクロリットルの細胞溶解液を96ウェル培養プレートから白色の低容量384ウェルマイクロプレートのウェルに慎重にピペットする。
次に、陽性対照溶解液15マイクロリットルおよび陰性対照として15マイクロリットルの1X溶解緩衝液を加えてアッセイウェルを分離する。15マイクロリットルの溶解物を含むウェルに、対応する4倍抗体検出ミックスを5マイクロリットル加えて、リンタンパク質または総タンパク質を検出する。プレートをプレートシーラーで覆った後、アッセイキットに応じて室温で1時間~一晩インキュベートする。
インキュベーションが完了したら、接着プレートシーラーを取り外し、TR-FRET互換マイクロプレートリーダーでプレートを読み取る。U266B1細胞における総STAT1およびホスホ-STAT4を有するホスホ-STAT1およびA431細胞における合計STAT5を有するホスホ-STAT5の検出および定量のためのTR-FRETアッセイの結果は、濃度応答曲線を用いて表される。同様に、HeLa細胞におけるホスホ−STAT3および総STAT3ならびにホスホ−STAT6ならびに総STAT6の検出および定量のためのTR−FRETアッセイは、濃度応答曲線を用いて表される。
全体として、すべてのアッセイは、堅牢なTR-FRETシグナル、広いダイナミックレンジ、低いウェル間係数変動、および許容可能なシグナル対バックグラウンド比を示しました。JAK活性化剤、インターフェロンアルファ-2BおよびIL-4およびEGFによる細胞の処理は、特定のチロシン残基におけるSTATリン酸化の予想される濃度依存的増加を示したが、対応する総STATタンパク質は安定していた。JAK阻害剤およびエルロチニブの両方が、対応するホスホ−STATレベルを濃度依存的に阻害した。
浮遊細胞株におけるインターフェロンα−2Bによるホスホ−STAT4刺激、またはワンプレートプロトコルを用いた接着細胞株におけるIL−4によるホスホ−STAT6刺激の結果は、2プレートプロトコルを用いて得られたものと一致し、したがって、ワンプレートオールインワンウェルプロトコルへの2プレート転写プロトコルの成功した適応性を示した。浮遊細胞株を用いたホスホ-STAT1アッセイおよび付着細胞株を用いたホスホ-STAT3アッセイのプレート内変動性試験の結果は、HTSアプリケーションに対するこれらのホスホ-STATアッセイの堅牢性を実証しています。全細胞抽出物中に存在する活性ホスファターゼからのリン酸化タンパク質の脱リン酸化を防ぐために、溶解緩衝液をホスファターゼ阻害剤カクテルで補うことが不可欠である。
