このプロトコルは、感作放出によるFRET実験をより再現性と比較可能にする簡単な手順を提供する。FRETの主な利点は、動的プロセスに対処できるようにリアルタイムで測定することです。透過光倍数を使用してレーザー調整を行う場合は、トランスフェクトプロトプラストを含む8ウェルスライドを顕微鏡下に置きます。
空の井戸を選択した後、ラインスキャンモードとヒストグラムビューを選択し、レーザー強度を最小限に抑え、検出可能なバックグラウンドノイズに検出器のゲインを調整します。次に、対応する信号を記録しながら0.5%のステップでレーザー強度を増加させます。反射モードを使用してレーザー調整を行う場合は、空の井戸を選択し、反射フィルタを適用します。
反射モードをオンにして、検出器の波長範囲がレーザーの波長をカバーしていることを確認します。ラインスキャンモードとヒストグラム表示を選択し、レーザー強度を最小に下げ、検出可能なバックグラウンドノイズに検出器のゲインを調整します。次に、カバースリップの反射が見えるまで、それを戻す前に目標を最も低い位置に移動し、対応する信号を記録しながら0.5%のステップでレーザー強度を増加させます。
データ評価では、データを表/集計して信号強度でソートし、その後、相対レーザーパワーに対して信号強度をプロットし、同様の信号強度をもたらすレーザー強度を選択します。フォトマルチプライヤの調整のために、空の井戸を選択し、反射フィルタを適用し、反射モードに切り替え、検出器の波長範囲がレーザーの波長をカバーすることを確認します。ラインスキャンモードとヒストグラム表示を選択し、検出器のゲインを最大の半分に減らし、レーザー強度を検出可能なバックグラウンドノイズに調整します。
次に、カバースリップの反射が見えるまで、目的を最も低い位置に移動し、50~100ボルトのステップで検出器のゲインを大きくして、対応する信号を記録します。データ評価では、検出器ごとに検出器ゲインに対して強度をプロットし、個々の検出器ゲインを選択して同様の感度を得ます。画像取得では、適切なフィルタまたは二色性ミラーを選択し、すべてのチャンネルに同じ二色性ミラーを使用してラインスキャンを有効にし、ライブセルのイメージング用の水浸漬目的を選択し、適度なスキャン速度で12または16ビットスキャンを選択します。
次に、ドナー検出用の検出範囲を470~510ナノメートル、強化されたシアン蛍光タンパク質またはECFPのFRET対の場合のアクセクセクター検出用530〜600ナノメートルおよび強化された黄色蛍光タンパク質またはEYFPを定義する。前述のように検出器とレーザー設定を適用した後、必要に応じて、取得したレーザーパワーテーブルに基づいてレーザー強度を修正します。信号対雑音比が検出器のダイナミックレンジ全体をカバーしていることを確認します。
レーザー強度と検出器が一定に保ちながらピンホール径で微調整した後、少なくとも20個の細胞の画像を撮ってFRET測定を行います。クロストーク補正を決定するには、ドナー蛍光素のみを発現する細胞とアクセプターフルオロフォアのみを発現する細胞でFRET測定を行います。測定の較正のために、ドナーアクセクサ融合を発現する細胞でFRET測定を行う。
データ評価では、各プロファイルに 1 つのセルを含めないようにセルの行プロファイルを取得します。プロファイルをテキスト ファイルとして保存します。次に、データ セクションのテキスト ファイルのインポート オプションを使用して、テキスト ファイルをスプレッドシートにインポートします。
次に、max関数を適用して最大値を読み出し、ドナー排出ID、FRET排出IA、アクセクサ排出IA、および少なくとも4つのデータセット、ドナーのみ、受付者のみ、ドナー受け入れ者融合、および測定のためのカラムを持つテーブルに得られた値をリストします。レーザー調整により、レーザー強度の増加に伴う放出の線形増加が明らかになった。急勾配で示すように、514ナノメートル線の排出量は458ナノメートル線の排出量よりはるかに高かった。
一定のレーザーパワーで検出器のゲインを変化させることで、両方の分析された検出器の指数関数的な振る舞いが明らかになった。組み換え精製タンパク質で分析されたドナーとアクセクサの不一致とスペクトルブリードスルーとこれらのタンパク質を発現する細胞で分析した結果、細胞色素によって引き起こされる可能性が高い生細胞におけるスペクトルブリードスルーの決定を省略することは不可能であることを示しています。標識された真空ATPAサブユニット、VHA AECFP、およびVHA AEYFP間のフレット効率は、信号強度の増加に伴って低下しました。
これに対し、VHA E1 ECFP と VHA CEYFP の相互作用は、信号強度とは無関係であった。適切な光学部品の選択は、ドナーおよびアクピコンの検出に不可欠です。このプロトコルは、これらの実験で再現性を高めるために、生細胞のレシオメトリックセンサーに適用することもできます。
