このプロトコルは、ドナー消光およびアクセプター感作放出を使用してFRETを定量化するための段階的な実験プロセスおよび数学的アルゴリズムを記述する。生細胞におけるFRET効率を定量するには、蛍光タンパク質のクロストークと、顕微鏡セットアップにおける蛍光色素の相対発光および検出効率を決定する必要があります。クロストークは、1つの蛍光色素のみを発現する細胞をイメージングすることによって評価できます。
ドナーまたはアクセプター分子の検出効率の評価には、測定シグナルを生じさせるドナー分子とアクセプター分子の数の比率に関する知識が必要です。生細胞で発現する蛍光色素の数は細胞ごとに異なり、不明です。この方法で使用される較正プローブは、1対1のドナー・アクセプター融合タンパク質であり、ドナーおよびアクセプター分子の相対的な検出効率を決定することを可能にする。
まず、EGFP mCherry 1融合プローブを生成するために、mCherry 1を含むN1哺乳動物細胞発現ベクターを使用します。終止コドンを持たないEGFPを細胞1つのBAM h1フラグメントとして増幅するオリゴヌクレオチドを設計する。緑色蛍光タンパク質と赤色蛍光タンパク質の間の5つのアミノ酸リンカーは、GFPチェリードナー-アクセプターペアの平均FRET欠損を0.25〜0.3に生じるはずです。
フェノールレッドを含まない細胞株と培地を使用して、バックグラウンド蛍光を低減します。細胞が80%コンフルエントになったら、1ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAでそれらを剥離し、5ミリリットルの細胞懸濁液から3滴を加えて、約10, 000個の細胞を8ウェルプレートの各ウェルに播種します。プレーティングの24時間後、適切なトランスフェクション培地を用いて細胞をトランスフェクトします。
生細胞イメージングの前に細胞を20時間インキュベートして、適切な蛍光タンパク質の発現、折り畳み、成熟を可能にします。共焦点走査型顕微鏡を用いて、摂氏37度で加湿および加熱された環境チャンバー内の細胞を画像化します。生理的pHで細胞培地を緩衝するには、20ミリモルのHEPESを添加して、細胞培地を二酸化炭素に依存しないようにします。
次に、スライドを顕微鏡に取り付けます。アルゴンイオンレーザーの488ナノメートルラインを使用してGFPを励起し、561ナノメートルのダイオードレーザーを使用してチェリーを励起します。チャネル1から505〜530ナノメートルの発光帯を介して励起用に488ナノメートルのレーザーをセットアップし、585ナノメートルを超えるロングパスフィルターを使用してチャネル2に励起します。
585ナノメートルを超えるロングパスフィルターを備えたチャネル3での励起には、561ナノメートルのレーザーを使用します。2つのレーザーを順番に励起し、各ラインの後にイメージングモードを切り替えて、各ラインの後に512 x 512ピクセルの画像の励起が交互になるように設定します。3つの画像のミニ時系列を設定して、著しい光退色が発生するかどうかを検出し、必要に応じてレーザー出力を減らします。
まず、GFPチェリー融合構築物を発現する細胞を画像化する。共焦点画像のピクセルあたりの時間積分レーザー強度を定義するパラメーターを設定します。63倍のオイル対物レンズを使用し、3倍に設定したズームを使用して、十分な倍率と解像度でセル全体を画像化します。
70〜80ナノメートルのピクセルサイズを目指します。ピクセル滞留時間を2〜4マイクロ秒に設定し、488ナノメートルおよび561ナノメートルレーザーのAOTF伝送により、画像が漂白や蛍光強度の飽和を示すピクセルなしで良好な信号対雑音比を示すようにします。チャンネル1とチャンネル3の信号レベルが等しくなるように、488と561のレーザー出力を調整します。
写真乗数ゲインを600〜800に設定します。画像15〜20は、GFPを発現する細胞、サクランボ融合タンパク質を発現する細胞、サクランボ、GFPおよびチェリー、および非トランスセクテッド細胞である。次に、GFPおよびチェリーにそれぞれ結合した目的のタンパク質を共発現する細胞を画像化する。
FRETを計算するには、チャネル1、488ナノメートルの励起と505〜530ナノメートルの発光バンドを持つドナーチャネルのドナー信号を測定します。次に、チャネル3のアクセプターシグナル、561ナノメートル以上の励起および585ナノメートルでの発光を伴うアクセプターチャネルを測定します。最後に、チャネル2、つまり488ナノメートルの励起と585ナノメートル以上での発光を伴う転送チャネルのFRET信号を測定します。
チャネル2の信号は、4つの異なる成分の合計です:消光されたドナー信号からクロストーク係数S1による585を超える検出チャネルへのスペクトルスピルオーバー、クロストーク係数S2による488ナノメートルの光による直接励起からのアクセプター信号、励起されたドナー分子からのFRETによるアクセプターの感作放出、 とバックグラウンド信号。得られた画像は、ドナーチャネル、トランスファーチャネル、およびアクセプターチャネルにおいて得られた、GFPのみを発現する細胞、チェリーのみ、GFPおよびチェリーを共発現する細胞、ならびにGFPチェリー融合タンパク質が示されている。GFPチェリー融合タンパク質を発現するNRK細胞およびGFPチェリーを共発現するNRK細胞で計算された平均細胞FRET効率を、各細胞における受容体対ドナー比強度比または分子比に対してプロットします。
GFPチェリー融合タンパク質を発現し、ネガティブコントロールとしてGFPとチェリーを共発現し、アシュウェル・モレル受容体の受容体サブユニットを発現する細胞のピクセルごとの正規化されたFRET画像をここに示す。ラット肝レクチンのRHL1および2は、原形質膜の細胞質側にGFPおよびチェリーで標識された。GFP RHL1およびチェリーRHL2およびGFP RHL1デルタストックおよびチェリーRHL2を発現する細胞の平均細胞FRET効率を、受容体対ドナー分子比に対してプロットした。
提示された定量的FRETアプローチは、以下を可能にする。生細胞の生理学的状況におけるタンパク質相互作用の検出。時間の経過に伴うタンパク質相互作用の変化。
共焦点画像のピクセルレベルまでの細胞内コンパートメントでの相互作用の違い。検出されたFRETシグナルの生細胞で発現した分子受容体対ドナー比への依存性を示す。
