軟骨下骨肥厚、または硬化症は、動物モデルおよびヒトの両方において、変形性関節症の特徴の1つである。現在、組織学的軟骨下骨肥厚の重症度は、主に半定量的グレーディングシステムに基づく視覚的推定によって決定される。この研究は、内側半月板の不安定化によって誘発される膝OAのマウスモデルにおいて、軟骨下骨の厚さを定量的に測定するための再現性があり容易に実行されるプロトコルを開発することを目的としている。
手術用顕微鏡下で行う内側半月板の外科的不安定化と無菌状態により変形性膝関節症のマウスモデルを作成した。マウス膝関節の組織学的プロセスには、組織固定、脱灰、トリミング、処理、埋め込み、切片化、および染色、続いて顕微鏡画像化が含まれる。画面上の画像は、関節軟骨病変を有するマウス変形性膝関節症、骨棘形成、および軟骨下骨肥厚を示す ImageJソフトウェアによる骨関節炎性軟骨下骨の定量的測定。
imagej.nih.gov/ij からImageJをダウンロードしてください。画像Jを開きます。[ファイル]タブをクリックし、[開く]オプションをクリックして組織図を開きます。
ファイルのディレクトリアドレスを見つけ、画像ファイルを選択して、[開く] をクリックします。直線ツールを使用して長さの 1 単位 (マイクロメートル) をスケッチし、「解析」、「スケールの設定」の順にクリックします。既知の距離とピクセル縦横比を1に設定し、[OK]をクリックすると、ピクセル長を単位長(マイクロメートル)に変換できます。
測定係数を面積に設定します。「分析」をクリックしてから「測定を設定」をクリックし、新しいウィンドウの下にある「面積としきい値に制限」ボックスにチェック・マークを付けます。このステップでは、選択したしきい値内のパラメータ領域を測定するように ImageJ を設定します。
軟骨下皮質板および皮質板に隣接する下層の骨梁骨の一部をカバーするラジオに示されるように関心の軟骨下骨領域を定義。画像のメインウィンドウの下にある選択ツールを使用して、軟骨下骨領域全体の輪郭をスケッチします。選択ツールは、しきい値が選択された後の測定を制限するしきい値をシステムに提供します。
「分析」をクリックし、「測定」をクリックします。面積測定を含む結果ウィンドウが開きます。「編集」をクリックしてから「外側を消去」をクリックして、軟骨下骨領域全体の外側の領域を除外します。
[外側にクリア]オプションをクリックした後、軟骨下骨領域全体のみが表示されます。「画像」をクリックし、「調整」、次に「色のしきい値」をクリックして、しきい値の色ウィンドウを開きます。しきい値カラー ウィンドウの下部にある [オリジナル] をクリックして、画像を元の状態に復元します。
選択ツールを使用して、骨物質領域に小さなボックスを描画します。ウィンドウの下部にある「サンプルオプション」をクリックして、骨物質領域を定義します。選択した骨物質領域が赤色に変わります。
しきい値カラーウィンドウの下部にある「選択」をクリックして、面積測定しきい値を作成します。「分析」をクリックし、「ImageJ メインメニューで測定」をクリックします。骨物質面積測定結果が結果ウィンドウに表示されます。
全軟骨下骨面積及び骨物質面積のデータを保存する。観察者間および観察者内の変動性および再現性は、ピアソンの相関係数分析によって決定された。研究グループ間の差の有意性は、スチューデントt検定または一元配置分散分析を使用して決定し、続いて事後検定を行った。
この図は、上部パネルと下部パネルを示しています。上のパネルは、視覚的推定ベースの軟骨下骨グレーディングのためのShamおよびDMM群からの組織学的画像の顕微鏡写真を示す。下のパネルは、ImageJ支援定量的軟骨下骨測定のためのShamおよびDMM群からの組織学的画像の顕微鏡写真を示す。
Adobe Illustrator で作成された黄色の点線で囲まれたボックスは、関心のある軟骨下骨領域の合計を定義します。ボックス内の骨物質の領域はオレンジ色で強調表示されます。内側大腿骨顆および内側脛骨台頭における顕著な軟骨下骨肥厚は、ImageJソフトウェアを用いて定量化することができる。
この図において、観察者間変動試験は、内側脛骨高原および関心のある内側大腿骨顆領域における軟骨下骨厚さの第1および第2の測定の両方について、観察者間で高い再現性を示す。この図において、観察者内変動試験は、関心のある内側脛骨プラトーおよび内側大腿骨顆領域における第1および第2の軟骨下骨厚さ測定との間の高い再現性を示す。表1は、軟骨下骨厚の視覚的グレーディングとImageJ支援定量測定との間の再現性の比較分析を示す。
相関係数検定は、定量的測定が視覚的等級付けシステムよりも比較的再現性が高かったことを示唆している。この図は、内側大腿骨顆および内側脛骨高原における軟骨下骨厚さの視覚的グレーディングおよびImageJ支援定量的測定の比較感度分析を示す。視覚的推定グレーディングのための組織学的画像を3つのグループに分けた。
視覚スコアがゼロのDMM画像に対する3人の観察者全員からの定量的軟骨下骨厚さ値は、視覚スコアがゼロのシャム画像のそれよりも有意に高く、定量的測定が視覚的等級付けよりも軽度の軟骨下骨肥厚に対してより敏感であることを示している。骨関節炎性軟骨下骨厚さの定量的測定のために新たに開発されたプロトコルは、広く使用されている視覚的グレーディングシステムよりも軽度の軟骨下骨変化に対してより敏感である。そして、このプロトコルは、早期の変形関節炎性軟骨下骨変化を検出し、変形性関節症軟骨グレーディングと協調して変形性関節症治療のインビボ有効性を評価するために使用することができる。
