ここで実証された2つの剥離技術は、個々の桿体細胞下区画を単離し、健康な桿体および罹患した桿体の各特殊区画で起こる重要な生理学的プロセスを明らかにするのを助けることができる。マウス網膜から異なる桿体細胞区画を単離することは困難な場合があります。これらの簡単な技術は、安価で一般的なラボ材料を使用して、タンパク質分析のためにロッド細胞下コンパートメントを確実に分離します。
まず、100%酸素で泡立てたエイムズHEPESバッファーで満たされたペトリ皿にろ紙を置きます。次いで、ワイドボア転写ピペットを用いて、2〜3ヶ月齢のC57 Black 6Jマウスから解剖した1つの網膜長方形を移す。仕切られた網膜を凹ませ、光受容体が皿の底に向かって下を向いていることを確認します。
次に、ピンセットを使って、半分になった網膜の側面を軽くつかみ、ろ紙の上で動かします。網膜が中央に揃ったら、半分になった網膜がろ紙に触れて桿体外側セグメントを作成するか、ROSがろ紙付着するようにろ紙を上方に動かします。網膜が付着したろ紙を慎重に持ち上げて、エイムズHEPESバッファーから取り出します。
ろ紙の底面をペーパータオルの上に置き、2~3回軽くたいて乾かします。網膜のあるろ紙の側面にエイムズHEPESを一滴加え、もう一度ペーパータオルの上にろ紙を載せて乾かします。次に、網膜の入ったろ紙をシャーレに戻し、ピンセットを使って、半分になった網膜のすべての端をそっと押し上げ、ろ紙から四方を離します。
網膜をろ紙から繊細に剥がし、網膜の極端な周囲だけに触れて、その構造的完全性を維持します。次に、シャーレからろ紙を持ち上げ、ペーパータオル上の余分な液体を取り除き、網膜と接触する側がペーパータオルに接触しないようにする。部分ROS層を含むろ紙を氷上の標識チューブに入れ、剥離した網膜をエイムズHEPES緩衝液に沈めておく。
この半分になった網膜の剥離工程を約7~8回繰り返し、ROS層全体を除去します。各剥離後、ろ紙を同じチューブに入れて、1つの半分の網膜から単離されたすべてのROSを結合する。すぐに使用できるように、分離されたROSのすべてのろ紙の皮を含むチューブを氷の上に保管してください。
ピンセットを使用して、残りの剥離した網膜を適切なラベルの付いたチューブに移し、すぐに使用できるようにチューブを氷の上に保ちます。凍結乾燥用の網膜サンプルを調製するには、ろ紙片を置き、半分にした網膜を冷たいリンゲル緩衝液で満たされたペトリ皿に移す。次にピンセットを使って網膜を上向きになるように丁寧に裏返し、ろ紙の上に載せるように動かします。
ろ紙の端を上方に持ち上げて、半分になった網膜がろ紙に触れるようにします。引き続きろ紙をリンガーの溶液から取り出します。その後、ろ紙の底面をペーパータオルの上に置き、2~3回丁寧に軽く叩いて余分な液体を取り除きます。
次に、ピンセットでろ紙を拾い上げ、網膜のあるろ紙の側面に冷たいリンガーの滴を加えます。もう一度、ペーパータオルの上にろ紙を置き、余分な液体を取り除きます。付着した各網膜およびろ紙サンプルを、すべてのサンプルを凍結する準備ができるまで、冷たいリンゲルで満たされたペトリ皿に保管する。
次に、ピンセットを使用して、各サンプルをコールドリンガーのバッファーから持ち上げ、ピンセットが濾紙の端のみに接触するようにして、網膜の半分を避けます。各ろ紙の底面をペーパータオルの上に置き、余分な液体を除去した。その後、網膜が付着しているろ紙の側面に冷たいPBSを一滴加え、再度ペーパータオルにろ紙を軽くたたきます。
すべてのろ紙片をシャーレに入れ、糸くずの出ないティッシュペーパーを使用して、ろ紙を囲む余分な液体を吸い取ります。次に、皿全体をアルミホイルでしっかりと包み、アルミホイルの端が固定され、ペトリ皿の底にスムーズに押し込まれていることを確認します。アルミホイルの蓋に0.1~0.2ミリメートルの穴を数個穿刺します。
次に、金属トングを用いて、アルミ箔で覆われたシャーレを液体窒素に徐々に下げる。凍結乾燥の準備が整うまで、サンプルを液体窒素に保管してください。凍結乾燥のために、アルミ箔で覆われたペトリ皿を凍結乾燥フラスコに入れ、製造業者のプロトコルに従って凍結乾燥機に取り付ける。
網膜を30分間凍結乾燥する。凍結乾燥後、凍結乾燥された網膜の上に小さなテープを慎重に敷き詰め、ピンセットでわずかな圧力をかけて感光体層と結合するようにして、ロッドの外側と内側のセグメントを収集します。テープをゆっくりと剥がし、ROSとRISの両方がテープに付着していることを確認します。
薄い白色のフィルムが破断面に存在する。これが RIS です。この RIS を分離するには、別のテープを配置し、破断面にテープを押し下げます。
次に、オレンジピンク色の層のみを含むテープ片をROSとラベル付けされた微量遠心管に入れ、薄い白色層を有するテープ片をRISとラベル付けされた別のチューブに入れる。次に、テープを用いて、厚く白い層を剥離してろ紙上に位置する残りの網膜組織を採取する。次に、この分離液をOISとラベルの付いたチューブに入れます。
同じ日に使用する場合は、凍結乾燥網膜から単離した層を室温で保存する。暗適応動物では、GNAT1とARR1の分布は既知の暗状態分布と密接に一致し、GNAT1信号はROS分離で目に見えて最も強く、ARR1信号はROS分離でより堅牢でした。GNAT1およびARR1シグナルの定量化は、ROSおよびROSサンプルにおけるGNAT1およびARR1の暗光条件間に有意差を示した。
暗適応サンプルと明適応サンプルの両方で、Gビート5S、シトクロムC、およびアクチンシグナルはROSサンプルから除外され、他の細胞層からの汚染がないことが実証されています。さらに、Gβ5LシグナルはROSサンプルにおいて明瞭に視認できた。無傷で剥離した凍結乾燥網膜の表面の走査型電子顕微鏡観察は、粘着テープで剥離する前に、無傷の凍結乾燥網膜の表面が特徴的な円筒状ROSに密接に一致することを示した。
最初のテープ剥離の後、ROSおよびRISは完全に除去されたように見え、残りの剥離された凍結乾燥網膜の表面に存在する均一な核層によって証明された。その後テープは剥離し、剥離層のフリー表面からRISを除去した。この技術はまた、GRK1免疫反応性が光曝露網膜中のROSサンプルにおいて最も強く、OISサンプルでは存在しないことを実証した。
逆に、ROSおよびRISサンプルは、免疫蛍光染色によってROSまたはRISでは一般に検出されないPKCアルファに対するかすかなシグナルを示した。最後に、最適でないテープ剥離は、わずかに汚染されたサンプルを生成する可能性がある。RISサンプルはいくつかのOISサンプルで汚染され、Gβ5LおよびGベータ5Sバンドの両方、およびより高いPKCアルファ信号を生成した。
網膜を凍結乾燥するときは注意が必要です。不適切な凍結乾燥技術を使用すると、網膜が融解し、テープで異なる桿体細胞層を単離することが不可能になることがあります。このテープ剥離法をqRT-PCRと組み合わせて使用すると、網膜の残りの部分から光受容体転写産物を分離することができました。
