Burada gösterilen iki soyma tekniği, bireysel çubuk hücre altı bölmelerini izole eder ve sağlıklı ve hastalıklı çubuklarda her bir özel bölmede meydana gelen önemli fizyolojik süreçleri ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Farklı çubuk hücresi bölmelerini fare retinasından izole etmek zor olabilir. Bu basit teknikler, protein analizi için çubuk hücre altı bölmelerini güvenilir bir şekilde izole etmek için ucuz ve yaygın laboratuvar malzemeleri kullanır.
Başlamak için,% 100 oksijen ile kabarcıklanmış Ames HEPES tamponu ile doldurulmuş bir Petri kabına bir parça filtre kağıdı yerleştirin. Ardından, geniş delikli bir transfer pipeti kullanarak, iki ila üç aylık C57 Black 6J fareden diseke edilmiş bir retinal dikdörtgeni aktarın. Bölümlenmiş retinayı içbükey yukarı doğru yönlendirin ve fotoreseptörlerin çanağın dibine doğru aşağı baktığından emin olun.
Ardından, cımbız kullanarak, yarıya indirilmiş retinanın kenarlarını hafifçe kavrayın ve filtre kağıdının üzerine getirin. Retina ortalandıktan sonra, filtre kağıdını yukarı doğru hareket ettirin, böylece yarıya indirilmiş retina, çubuk dış segmenti oluşturmak için filtre kağıdına veya filtre kağıdı yapışmasını sağlamak için ROS'a dokunur. Takılı retina ile filtre kağıdını dikkatlice Ames HEPES tamponundan kaldırın.
Filtre kağıdının alt tarafını bir kağıt havluya yerleştirin ve kuruması için iki ila üç kez sürün. Filtre kağıdının retina ile yan tarafına bir damla Ames HEPES ekleyin ve filtre kağıdını kuruması için tekrar kağıt havluya yerleştirin. Ardından, retinalı filtre kağıdını Petri kabına geri yerleştirin ve cımbız kullanarak, yarıya indirilmiş retinanın tüm kenarlarını yavaşça yukarı ve her taraftaki filtre kağıdından uzağa doğru itin.
Retinayı filtre kağıdından nazikçe soyun ve yapısal bütünlüğünü korumak için retinanın yalnızca aşırı çevresine dokunun. Ardından, filtre kağıdını Petri kabından kaldırın ve retina ile temas eden tarafın kağıt havluya temas etmemesini sağlamak için bir kağıt havlu üzerindeki fazla sıvıyı çıkarın. Kısmi ROS tabakasına sahip filtre kağıdını buz üzerindeki etiketli bir tüpe yerleştirin ve soyulmuş retinayı Ames HEPES tamponuna batırılmış halde tutun.
Tüm ROS tabakasını çıkarmak için bu yarıya inmiş retina için soyma işlemini yaklaşık yedi ila sekiz kez tekrarlayın. Her soyulduktan sonra, yarıya indirilmiş bir retinadan izole edilen tüm ROS'ları birleştirmek için filtre kağıdını aynı tüpe yerleştirin. İzole edilmiş ROS'un tüm filtre kağıdı kabuklarını içeren tüpü hemen kullanmak üzere buz üzerinde tutun.
Cımbız kullanarak, artık soyulmuş retinayı uygun şekilde etiketlenmiş bir tüpe aktarın ve tüpü hemen kullanmak için buz üzerinde tutun. Retina örneğini liyofilizasyona hazırlamak için, bir parça filtre kağıdı yerleştirin ve yarıya indirilmiş bir retinayı soğuk Ringer tamponuyla dolu bir Petri kabına aktarın. Daha sonra, cımbız kullanarak, retinayı dikkatlice çevirin, böylece içbükey yukarı doğru yönlendirilir ve filtre kağıdının üstünde duracak şekilde hareket ettirin.
Yarıya indirilmiş retina parçasının filtre kağıdına temas etmesi için filtre kağıdını kenarlarından yukarı doğru kaldırın. Filtre kağıdını Ringer'ın çözeltisinden çıkarmaya devam edin. Ardından, filtre kağıdının alt tarafını bir kağıt havluya yerleştirin ve fazla sıvıyı çıkarmak için iki ila üç kez dikkatlice sokun.
Ardından, filtre kağıdını cımbızla alın ve retinalı filtre kağıdının yan tarafına bir damla soğuk Ringer ekleyin. Yine, fazla sıvıyı çıkarmak için filtre kağıdını kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Yapıştırılan her retina ve filtre kağıdı numunesini, tüm numuneleri dondurmaya hazır olana kadar soğuk Ringer'larla dolu bir Petri kabında saklayın.
Ardından, cımbız kullanarak, her bir numuneyi soğuk Ringer'ın tamponundan kaldırın ve cımbızların yalnızca filtre kağıdı kenarlarına temas etmesini sağlayarak yarıya inmiş retinadan kaçının. Fazla sıvıyı çıkarmak için her filtre kağıdının alt tarafını bir kağıt havluya yerleştirin. Ardından, filtre kağıdının retinanın yapıştığı tarafına bir damla soğuk PBS ekleyin ve filtre kağıdını tekrar kağıt havluya batırın.
Tüm filtre kağıdı parçalarını Petri kabına yerleştirin ve tüy bırakmayan kağıt mendil kullanarak, filtre kağıdını çevreleyen fazla sıvıyı uzaklaştırın. Ardından, tüm kabı alüminyum folyo ile sıkıca sarın ve alüminyum folyonun kenarlarının sabitlendiğinden ve Petri kabının dibine düzgün bir şekilde bastırıldığından emin olun. Alüminyum folyo kapağına bir avuç dolusu 0,1 ila 0,2 milimetrelik delik açın.
Daha sonra, metal maşalar kullanarak, alüminyum folyo kaplı Petri kabını kademeli olarak sıvı azota indirin. Liyofilize olmaya hazır olana kadar numuneleri sıvı azot içinde tutun. Liyofilizasyon için, alüminyum folyo kaplı Petri kabını dondurarak kurutma şişesine yerleştirin ve üreticinin protokolünü izleyerek liyofilizatör makinesine takın.
Retinayı 30 dakika boyunca liyofilize edin. Liyofilizasyondan sonra, liyofilize retinanın üzerine dikkatlice küçük bir bant parçası yerleştirerek ve fotoreseptör tabakasıyla yapışmasını sağlamak için cımbızla hafif basınç uygulayarak çubuk dış ve iç segmentini toplayın. Bandı yavaşça soyun ve hem ROS hem de RIS'nin banda yapıştığından emin olun.
Kırık yüzeyde ince, beyaz bir film bulunacaktır. Bu RIS'dir. Bu RIS'yi ayırmak için, başka bir bant parçası yerleştirin ve bandı kırık yüzeye aşağı doğru itin.
Ardından, sadece turuncu-pembe tabakalı bant parçasını ROS olarak etiketlenmiş bir mikrosantrifüj tüpüne ve ince, beyaz tabakalı bant parçalarını RIS etiketli başka bir tüpe yerleştirin. Daha sonra, bant kullanarak, kalın, beyaz tabakayı soyarak filtre kağıdında bulunan kalan retinal dokuyu toplayın. Ardından, bu izolatı OIS etiketli bir tüpe yerleştirin.
Aynı gün kullanıyorsanız, liyofilize retinadan izole edilmiş katmanları oda sıcaklığında saklayın. Karanlığa adapte olmuş hayvanlarda, GNAT1 ve ARR1'in dağılımı, GNAT1 sinyalinin ROS izolasyonunda gözle görülür şekilde en güçlü olduğu ve ARR1 sinyalinin ROS izolasyonunda daha sağlam olduğu bilinen karanlık hal dağılımlarıyla yakından eşleşti. GNAT1 ve ARR1 sinyallerinin nicelleştirilmesi, ROS ve ROS örneklerinde GNAT1 ve ARR1 için karanlık ışık koşulları arasında önemli farklılıklar göstermiştir.
Hem karanlık hem de ışığa adapte olmuş numunelerde, G beat 5S, sitokrom C ve aktin sinyalleri ROS numunelerinden hariç tutulur ve bu da diğer hücresel katmanlardan kontaminasyon olmadığını gösterir. Ek olarak, G beta 5L sinyali ROS örneklerinde açıkça görülebiliyordu. Sağlam ve soyulmuş liyofilize retina yüzeylerinin taramalı elektron mikroskopisi, yapışkan bantla soyulmadan önce, sağlam liyofilize retina yüzeyinin karakteristik silindirik ROS ile yakından eşleştiğini göstermiştir.
İlk bant soyulmasından sonra, ROS ve RIS, artık, soyulmuş, liyofilize retinanın yüzeyinde bulunan düzgün nükleer tabaka ile kanıtlandığı gibi, tamamen çıkarılmış gibi görünüyordu. Sonraki bant soyulmaları, soyulmuş tabakanın serbest yüzeyinden RIS'yi çıkardı. Bu teknik aynı zamanda GRK1 immünoreaktivitesinin ışığa maruz kalan retinadaki ROS örneklerinde en yoğun olduğunu ve OIS örneklerinde bulunmadığını göstermiştir.
Tersine, ROS ve RIS örnekleri, PKC alfa için soluk bir sinyal gösterdi ve bu genellikle immünofloresan boyama ile ROS veya RIS'de tespit edilmedi. Son olarak, yetersiz bant soyma işlemi hafif kontamine numuneler verebilir. RIS örneği, hem G beta 5L hem de G beta 5S bantları ve daha yüksek bir PKC alfa sinyali üreten bazı OIS örnekleri ile kontamine olmuştur.
Retinayı liyofilize ederken dikkatli olunmalıdır. Uygun olmayan bir liyofilizasyon tekniği kullanılırsa, retina eriyebilir ve farklı çubuk hücre altı tabakalarının bantla izole edilmesini imkansız hale getirebilir. Bu bant soyma yönteminin qRT-PCR ile birlikte kullanılması, fotoreseptör transkriptlerinin retinanın geri kalanından ayrılmasını sağlamıştır.
