タツノオトシゴXF分析装置を用いて酸素消費率を直接測定する新しい方法を開発しました。しかし、成体マウス由来の急性スライドスライスにおけるミトコンドリア機能のための一般的なプロキシ。この方法は、解剖学的に定義された脳構造からの穿刺におけるエネルギー学によって細胞を測定する。
急性スライスを使用すると、ミトコンドリア細胞または培養細胞を単離する方法では達成できない生理学的細胞環境をより厳密に模倣する。この方法は、パーキンソン病およびハンチントン病の分野で働く研究者にとって幅広い関心事となるであろう。まず、細胞外フラックスアッセイキットを開き、センサーカートリッジとユーティリティプレートの両方を取り外します。
次に、センサーカートリッジを脇に置き、センサーに触れないでください。次に、ユーティリティプレートの各壁に600マイクロリットルの校正溶液を追加します。センサー・カートリッジをユーティリティー・プレートの上に置き、センサーをキャリブレーション・ソリューションに沈めて、ユーティリティー・プレートとセンサー・カートリッジ・プレートの三角形の切り込みが正しく揃っていることを確認します。
その後、細胞外フラックスアッセイキットをシーリングフィルムで密封して、校正溶液の蒸発を防ぎ、二酸化炭素または酸素を補充していない摂氏37度のインキュベーターに一晩置きます。ハトメキャプチャマイクロプレートを開き、組織を座らせるためにハトメプレートを取り出す。次いで、50ミリリットルのチューブ中で、予め酸素化された修飾された人工脳脊髄液緩衝液の適切な体積を摂氏37度に温める。
次に、BSAを1ミリリットルあたり4ミリグラムの最終濃度に加え、呼吸バッファーを調製した。プレートの揺れを避けながら、625マイクロリットルの呼吸バッファーをアイレットプレートの各ウェルに慎重に加え、各ウェルのバッファーに気泡が存在しないことを確認します。直ちに10ミリリットルの氷冷予備酸素化切断溶液で脳を解剖する。
次いで、ビブラトーム断面冠状線条体スライスを用いて、氷冷予備酸素化切断液中で厚さ150マイクロメートルで製造業者の指示に従った。次に、スライスを50ミリリットルの酸素化人工脳脊髄液中に回収する。そして、室温で最大30分間溶液中に保管してください。
回復後、スライスを5ミリメートルの呼吸バッファーを備えた35 x 10ミリメートルのペトリ皿に移します。ステンレス製の生検パンチを使用して、スライスをバッファーに保持しながらパンチを静かに押さえることによって、スライスされた脳の所望の領域に円形の組織片を作成する。その後、残りの組織を取り出し、パンチを持ち上げて、円形の組織片を緩衝液に取り除きます。
次に、1ミリリットルのピペットチップの端をカットして直径1点5~2点ゼロミリメートルの穴を開け、それを使ってパンチしたスライスを保持し、キャプチャ画面の上部に移します。パンチされた脳組織の1枚を吸引し、キャプチャスクリーンのメッシュ側に組織を慎重に配置します。紙のティッシュを使用してキャプチャ画面を静かに乾燥させ、水分を除去すると、ティッシュが粘着性になり、メッシュの中心に付着します。
次に、ピンセットでキャプチャ画面をスライス面下に持ち、インキュベートアイレットプレートのウェルの1つに置きます。次いで、アッセイを実行する前に、温度およびpH平衡を可能にするために、インキュベーター内で37°Cでハトメプレートを少なくとも30分間インキュベートする。BSAを含まない所望の化合物および修飾人工脳脊髄液を、それぞれポートA〜Dに対する作業濃度の最終ストック濃度まで希釈する。
完全に挿入すると、ポートを介して化合物が漏れる可能性があるため、チップを注入ポートの壁に45度の角度で注入ポートの途中に配置して、希釈化合物の75マイクロリットルをセンサーカートリッジの適切な注入ポートに穏やかにプリロードします。その後、気泡を発生させずにポートからチップを慎重に引き出し、気泡を緩和しないようにカートリッジのどの部分もタップしないでください。次に、注入ポートを目視で検査して、すべての液体がポートにあり、カートリッジの上部に残留滴がないことを確認します。
センサーカートリッジをユーティリティプレートに置いた後、ユーティリティプレートにつかまり、できるだけ動かないように慎重に取り扱いながら、摂氏37度まで加熱できるようにインキュベーターに30分間入れます。まず、ソフトウェアにアッセイテンプレートをロードし、次に緑色のスタートボタンを押します。次に、ユーティリティプレートのセンサーカートリッジを機器トレイにロードし、プレートが正しく収まり、平らであることを確認し、薬物で満たされたセンサーカートリッジを分析装置にロードして校正します。
その後、画面の指示に従ってキャリブレーションします。センサーを平衡化します。平衡化ステップが完了したら、キャリブレーションプレートを取り外し、メッシュと組織スライスを含むハトメプレートと交換します。
次いで、プレートの各ウェルにおける酸素消費速度を測定し、原稿に記載されているアッセイプロトコールを使用する。以下、酸素消費率測定データ及び結合効率データを解析する。対照群におけるスライスの異なる厚さおよびパンチサイズに対する酸素消費率は、測定全体にわたって安定した基礎呼吸を示し、スライスの体積に比例した。
さらに、酸素消費速度は5時間にわたって比較的安定しており、ランダウンは10%未満であった。ミトコンドリア結合効率を比較し、厚さ150マイクロメートル、パンチサイズ1.5ミリメートルのスライスが最も高い結合効率を示した。酸素消費率は、Pink1ノックアウトの若年群および若齢群およびそれらの年齢が一致した野生型マウスについて測定された。
基礎酸素消費率は、若齢マウスのノックアウト型群と野生型群の両方で同様であった。しかし、旧群のノックアウトマウスについては減少した。しかし、ノックアウトマウスのミトコンドリア機能障害は若年層で観察され、Pink1のノックアウトによる結合効率の低下によって示された。
このプロトコルの重要なステップには、脳スライスの準備、キャプチャ画面の上部への転送、ウェルへのスライドの配置、測定中にキャプチャ画面に貼り付けたままにしておくことが含まれます。
