This video article is sponsored by Cerebos Pacific Limited. This work is supported by National Medical Research Council Collaborative Research Grant (NMRC-CBRG-0041/2013) and Ministry of Education Academic Research Funding (MOE AcRF- Tier 1 - T1-2012 Oct -02).

すべての動物の手順は、シンガポール国立大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。 人工脳脊髄液の1.準備（ACSF） <ol><li> 、124のNaCl、3.7塩化カリウム（MM）でのMgSO 4・7H 2 O 1.0、2.5のCaCl 2・2H 2 OからなるACSF、1.2 KH 2 PO 4、24.6のNaHCO 3、および10 D-グルコースを準備します。解剖、スライス標本と電気生理学的記録の間の灌流のための両方のために、このACSF 95％O 2および5％CO 2混合物 （カーボゲン）。21を使用した、飽和に泡立てたときにACSFのpHは7.2から7.4の間であることを確認してください。 注：ACSFを測定し、保持するためのクリーンな装置を使用してください。汚れた装置を使用して、濁った溶液又は沈殿物の形成をもたらすことができます。すべての準備のために脱イオン水を使用してください。 </li><li> NaHCO 3を除いた2リットルの10倍のACSFの株式を準備</sUB&gt;とメスフラスコ中のD-グルコース。塩化ナトリウム（144.96グラム）、塩化カリウム（5.52グラム） し 、MgSO 4・7H 2 0（4.92グラム）、塩化カルシウム2・2H 2 O（7.56グラム）、KH 2 PO 4（3.28：次の順序で脱イオン水に試薬を追加2 Lの容積にグラム）とトップアップは、すべての試薬が溶解していることを確認するために、磁気撹拌機を用いて少なくとも30分間連続して攪拌します。 4°Cの中で株式を保存し、2週間以内に使用します。 </li><li>解剖や実験に先立ち、NaHCO 3およびD-グルコースの必要量を加えて一緒にメスフラスコにACSFの株式を希釈します。 1 L溶液は、2.07グラムのNaHCO 3および1.802グラムのD-グルコースを添加した後、1Lに株式の100ミリリットルを希釈。 ACSFは、沈殿物や未溶解粒子を含まない透明な溶液にする必要があります。 </li><li>クール200〜300 mlの氷のACSFの、解剖時に使用されます。解剖のために使用ACSFは2-4℃の間であることを確認してください。 electropの残りのACSFを使用しますhysiological実験。バブルすべてACSF溶液を連続的にカルボゲン（5％CO 2、95％O 2）で飽和します。 ACSFを冷却するために待っている間、解剖領域とスライス室を準備します。 </li></ol>インターフェイス商工会議所の調製注：スライスをインキュベートし、電気生理学的記録（ 図2B）の間にそれらを維持するために使用されるインターフェース脳切片室は、2つの区画で構成されています。下部チャンバは、温度制御装置により32℃に維持した水を蒸留し、連続的にカルボゲンを通気含ま。 <ol><li>温度コントローラに切り替え、32℃で、それをプリセット。流入管を通して蒸留水を実行して、10〜15分間、上部チャンバーを洗浄します。上室は、ネットを配置する前にクリーンであることを確認してください。下部チャンバー内の水位が蒸留水で満たされた約70％であることを確認してください。 </li><li>置きスライス（ 図2C）のための休息面を提供するために、上部チャンバーの純。ソリューションレベルは十分にネットの全領域を湿潤されることを保証するために流出チューブを調整します。上部チャンバー内の加湿カルボゲン雰囲気を維持するためにネット上に蓋を置きます。 </li><li> 1ml /分の流量を調整します。スライスのインキュベーション期間および実験を通して、この流量を維持します。新たに調製した1×ACSFをcarbogenating起動し、ACSFに流入チューブを浸します。 ACSFのための20分は、カルボゲンで、それに充填する上部チャンバーのために飽和させることができるようにします。 </li></ol>急性海馬スライスの調製注：解剖プロトコルは冷たいACSFに動物由来の脳の（1）の取り外しと（2）の単離および海馬のスライスで構成されています。ニューロンは、生存したままで分離し、すぐに冷たいACSFで脳を配置し、全体を完了するために、3-5分以内にスライスを含むプロセス。 <ol><li>風邪ACSFに脳の除去<ol><li> 図1（a）に示すようにして解剖ツールをレイアウト。解剖プロセスを促進するための使用のために応じてツールを配置します。開始する前に、すべての解剖ツールは準備ができていることを確認します。 </li><li>しっかりと固定し、カッティングエッジが均一に整列されていることを確認し、手動組織チョッパー（ 図1B）に、酢酸エチル、無水エタノール及び蒸留水で洗浄カミソリの刃を、マウントします。テストブレードがしっかりと固定されていることを保証するために、フィルター紙を細断。その開始位置にスライドバーニアマイクロメータを設定します。 </li><li>誘導室中の二酸化炭素（CO 2）を用いて動物を安楽死させると、包帯はさみやギロチンで首を切ります。アイリスのはさみを使用して、頭蓋骨上の皮膚や被毛を削除します。 brainstem.Makeに目に沿って小さな切開を除去するために、後部を切断してください頭蓋骨の右側と左側に長い切開を電子。 注意！それの損傷を防ぐために、実験のために使用された側にのみ小さな切開を行います。はさみを挿入する場合、適用される力は、脳への損傷を避けるために上向きであることを確認してください。 </li><li>慎重に皮質を明らかにするために頭蓋骨の右側に左から骨鉗子骨と頭蓋骨を削除します。硬膜の薄い層は、見ることができます。慎重に骨鉗子と正面プレートを取り外します。正面プレートと一緒に硬膜の大部分を削除します。 注意！硬膜は脳組織をスライスしないように注意してください。 </li><li>特にへらの平坦な端部と皮質と小脳の間の接合部に、もしあれば、残りの硬膜を削除します。ステップ3.1.5と3.1.6の場合は、それを損傷しないように離れて脳から、上向きすなわち圧力を維持します。へらを使用して、静かに冷たいで満たされたペトリ皿に脳をスクープし、ACSF（2-4°C）をcarbogenated、ナンプラーアルミ冷却ブロック上をced。 </li></ol></li><li>海馬の単離<ol><li>メスを用いて、脳（約1/4）の前方部分を削除するには、小脳、別のカットを削除するには、ストレートカットを行います。正中線に沿って浅いカットを行います。 </li><li>慎重に背側海馬を明らかに正中線から開始し、鎌スケーラーと皮質を除去します。海馬上記の皮質の層を削除します。脳をサポートするために、指や角度のついたピンセットを使用してください。海馬交連に小さなカットを行います。なだらかな動きを使用して、背側海馬から始まる鎌スケーラーで海馬を削除します。 注意！ストレッチや海馬を引き裂く避けるために穏やかなこと。 </li><li>鎌スケーラーで分離された海馬の周りの任意の皮質および結合組織を除去します。 </li></ol></li><li>海馬組織をスライスし、インターフェースチャンバー上にスライスを転送します<ol><li> ACSF-の作品を配置します手動スライサーのスライスステージ上浸したろ紙（グレード1、30ミリメートル）。スクープとろ紙上に海馬組織を配置します。海馬は采に約70 Oの角度でスライスされるように、スライサーの刃との関係で適切な方向で海馬を整列させるためにろ紙を移動します。 </li><li>少し湿った海馬を残して折り畳まれたろ紙（グレード1、85ミリメートル）と海馬組織を囲む余分な溶液を吸い取ります。横方向に海馬スライス開始します。スライスとスライス形態は明らかではない海馬の先端から組織を捨てること。 </li><li>厚さ400μmのスライスに残りの組織をスライス。穏やかなスワイプの動きを用いたソフト剛毛ブラシでブレードから優しく海馬スライスをピックアップし、冷たいcarbogenated ACSFで満たされた小さなビーカーにスライスを配置します。手順を実行し3.3.1-3.3.3、可能な限り迅速に海馬組織が空気に露出しているため。 注意：一般的に海馬の3分の2がスライスされて、明確な形態​​を有する4~6切片を調製することができます。 </li><li> （先端2〜3センチ離れて切断することによって作られた）幅広い先端で清潔なプラス​​チック製パスツールピペットを用いて、スライス室で静かにネット上にスライスを転送します。慎重に曲がった先端で小さな注射器を使用してネット上のスライスの位置を調整します。電極の位置と記録を容易にするようにスライスを配置します。スライスが十分にACSFに囲まれているが、水没または浮動（ 図2C-D）されていないことを確認します。チャンバーをカバーし、2〜3時間のスライスをインキュベートします。 注：健康スライスにおける錐体細胞層は、いくつかの透明性を示すべきです。 </li></ol></li></ol> 4.録音CA3-CA1シナプスの応答注：フィールドの潜在的な記録のために使用される電気のセットアップは 、図2Aに示されています。ファーラ電気的干渉は、電気の設定を適切に接地した後に制御を超えている場合はその日のケージを強くお勧めします。沈め、インターフェース室の多くの異なる種類が市販されています。しかし、インターフェース室は、その中のスライスを呈する、より堅牢なシナプス応答として好ましいです。 <ol><li>電極の位置決め<ol><li>使用する電気機器（刺激剤およびア​​ンプ）の電源を入れます。マウントとマイクロマニピュレーターのプレキシガラスホルダーに刺激と記録電極を固定します。 注：我々は両方の刺激と記録の目的のために5MΩ抵抗の単極、ラッカーでコーティングされた、ステンレス製の電極を使用しています。 </li><li>使用前に、引っ張らガラスキャピラリーの内部でこれらの電極を挿入し、電極先端部（ 図2E）のほんの一部を露出するエポキシ接着剤で固定します。これは、そうでない場合は細い電極に強度を与え、しっかりとELEでそれらを確保するのに役立ちますctrodeホルダー。 </li><li>顕微鏡下でガイド付き、フィールドEPSP（のfEPSP）応答を記録するために、シャファー側枝繊維とCA1の先端樹状領域での記録電極を刺激するためにCA1領域の放線層に刺激電極（複数可）を配置します。 注：電極とスライス上記液面へのアプローチは、すぐにスライス（提供、アンプがスピーカに接続されている）の表面を見つけるのに役立ちますサウンドを提供します。 </li><li>シナプスタグおよび捕捉の実験では、実験の必要性に応じて、記録電極の両側に位置二、三刺激電極（S1、S2またはS3）は、2つ以上の独立したが、重複入力を刺激します。離れて200ミクロン程度の刺激と記録電極を配置します。 </li><li>必要ならば、集合スパイク（ 図3A）を記録するための層の三角骨層内の他の記録電極を見つけ.When両方電極は適切なのfEPSP信号を確実にするために、テスト刺激を与え、取得ソフトウェアを使用して、スライスに触れています。 注：我々はテスト刺激のための二相性、定電流パルス（インパルス持続時間0.1ミリ秒/半波）を使用します。 </li><li>適切なのfEPSP信号が得られると、慎重に深いマニピュレータの微動ノブを使用して、200ミクロン程度の電極を下げます。スライスが回復するために20分を許可します。ペアのパルスの円滑プロトコル27,28と経路独立性をテストします。 </li></ol></li><li>入出力関係<ol><li>現在の強度の範囲で傾斜値を測定することによって、入力ごとに入出力関係（のfEPSPのスロープ対求心性刺激）を決定します。 100μA〜20μAの間でこれを実行します。そして、最大のfEPSPの傾きの40％を取得するために、各入力のための刺激強度を設定します。実験を通じて、この一定に保ちます。 </li><li> 15〜20分後、ベースラインの記録を開始。 Fを監視この期間中に密接にEPSPスロープおよびスロープが設定値から10％以上変動し、新しいベースラインを起動した場合刺激強度をリセットします。録音先に進む前に、少なくとも30分または1時間安定したベースライン。 注：テストまたはベースライン刺激のために、私たちは5分ごとに与えられた0.2 Hzの二相性、定電流パルスの4スイープ（極性あたり0.1ミリ秒）を使用します。これら四つの応答の平均勾配は、その後、1リピートとして考えられています。信号は、差動増幅器によってフィルタリングされ、増幅され、アナログ - デジタル変換器を用いてデジタル化し、カスタムメイドのソフトウェアを使用してオンラインでモニターしました。 </li></ol></li><li> LTP / LTDの誘導刺激プロトコルを使用して 注：タンパク質合成の要件に基づいて、LTPとLTDの両方が早くも分類されていると後期LTP / LTD。その後半メンテナンスのため、後者が必要な翻訳および/ ​​または転写【レビュー4を参照してください ]。電気刺激パラダイムの様々なspecificallことができますyは、LTPとLTDの異なる形式を誘発します。 <ol><li> WTET：100ヘルツ、21二相性定電流パルス（相あたり0.2ミリ秒）。 </li><li> STET：1秒（100 Hz）で10分毎に（相あたり幅0.2ミリ秒パルス）のための100パルスの三つのバースト。 </li><li> 15分の期間にわたって900バースト。 1バーストは、50ミリ秒（20 Hz）との間間隔で3パルス（0.2ミリ幅）で構成されています。インターバースト間隔は1秒（パルス2700の総数）です。 </li></ol></li></ol>スライス室と灌流システムの5.洗浄<ol><li>録音が終わった後、さらに生化学的解析のために海馬スライスを収集したり、他の適切に廃棄します。カーボゲンの電源電圧および温度コントローラの電源を切ります。蒸留水にカーボゲンバブラーを洗ってください。 </li><li>ブラシと蒸留水で徹底的にネットを清掃してください。高い流量で蒸留水で15〜20分間リグを洗ってください。 3-4日に1回、蒸留水を変更また、下部チャンバの区画と真菌の増殖を避けるために、3％過酸化水素溶液で定期的にチャンバを洗浄。 </li></ol>

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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisomycin+inhibits+the+late+maintenance+of+long-term+depression+in+rat+hippocampal+slices+in+vitro.">Anisomycin inhibits the late maintenance of long-term depression in rat hippocampal slices in vitro.</a> Neuroscience Letters. 338, 147-150 (2003).</li><li>Ishikawa, Y., Tamura, H., Shiosaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+neuropsin+(KLK8)-dependent+synaptic+associativity+in+the+hippocampal+pyramidal+neuron.">Diversity of neuropsin (KLK8)-dependent synaptic associativity in the hippocampal pyramidal neuron.</a> The Journal of physiology. 589, 3559-3573 (2011).</li><li>Ishikawa, Y., Horii, Y., Tamura, H., Shiosaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropsin+(KLK8)-dependent+and+-independent+synaptic+tagging+in+the+Schaffer-collateral+pathway+of+mouse+hippocampus.">Neuropsin (KLK8)-dependent and -independent synaptic tagging in the Schaffer-collateral pathway of mouse hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 843-849 (2008).</li><li>Sajikumar, S., Morris, R. G. M., Korte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+between+recently+potentiated+synaptic+inputs+reveals+a+winner-take-all+phase+of+synaptic+tagging+and+capture.">Competition between recently potentiated synaptic inputs reveals a winner-take-all phase of synaptic tagging and capture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 12217-12221 (2014).</li><li>Navakkode, S., Sajikumar, S., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+IV-specific+phosphodiesterase+inhibitor+rolipram+and+its+effect+on+hippocampal+long-term+potentiation+and+synaptic+tagging.">The type IV-specific phosphodiesterase inhibitor rolipram and its effect on hippocampal long-term potentiation and synaptic tagging.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 7740-7744 (2004).</li><li>Kohl, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity.">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nature. 14, 1413-1415 (2011).</li><li>Frey, U., Huang, Y. Y., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cAMP+Simulate+a+Late+Stage+of+LTP+in+Hippocampal+CA1+Neurons.">Effects of cAMP Simulate a Late Stage of LTP in Hippocampal CA1 Neurons.</a> Science. 260, 1661-1664 (1993).</li><li>Erdogdu, G., Uto, A., Hossmann, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+global+ischemia+and+recirculation+of+rat+brain+on+protein+synthesis+in+vitro.">The effect of global ischemia and recirculation of rat brain on protein synthesis in vitro.</a> Metab Brain Dis. 8, 199-206 (1993).</li><li>Djuricic, B., Berger, R., Paschen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+and+energy+metabolism+in+hippocampal+slices+during+extended+(24+hours)+recovery+following+different+periods+of+ischemia.">Protein synthesis and energy metabolism in hippocampal slices during extended (24 hours) recovery following different periods of ischemia.</a> Metab Brain Dis. 9, 377-389 (1994).</li><li>Park, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+long-term+potentiation+comprises+a+family+of+temporally+overlapping+forms+of+synaptic+plasticity+that+are+induced+by+different+patterns+of+stimulation.">NMDA receptor-dependent long-term potentiation comprises a family of temporally overlapping forms of synaptic plasticity that are induced by different patterns of stimulation.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369, 20130131 (2014).</li></ol>

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急性海馬スライスは、LTPや、STC、クロスキャプチャなどの他の機能的可塑性のプロセスの研究のための優れたモデル系です。それは、海馬の回路の層構造のネットワークの多くを保存し、正確な電極位置を可能にし、血液脳関門なし、と並んで迅速な神経薬理学的操作のためのオープンプラットフォームを提供しています。 この記事では、若い成体ラットから実行可能な急性海馬スライスの調製のための方法論を説明し、STCとクロスタグ付けを調査するためにそれらを使用。これまでの研究は、性別や動物の年齢は電気生理学的研究で使用するために考慮すべき重要な因子であることを強調している。完全に表現成人受容体の機能（5-7週齢のWistar系雄性ラット）で27,28したがって、若い成体動物が使用されている。23非対称性左右の海馬との間の接続にげっ歯類29で指摘されており、NMDA受容体の発現に大きな違いがよく34として報告されています。私たちは以前のLTPの研究と一致するために、右海馬を使用している。23,32しかしながら、海馬のいずれかがあれば、整合性が維持されているとして使用することができます。 任意のプロトコルのように、それは、単離および組織が、伸び損傷し、乾燥または低酸素レンダリングされませんすぐに手続きをスライスするが世話を行うことが非常に重要です。 pH、温度および溶液のイオン組成の変化はスライスし、結果の実行可能性に大きな影響を持つことができます。したがって、このような変動は、避けるべきです。これは、製造工程中に発生するグルタミン酸受容体依存性カルシウム放出の不可逆的神経組織35,36、37でタンパク質合成に影響を与えることができることが観察されました。マニュアル組織スライサーを使用すると、VIと比較して非常に迅速に完了するためのプロセスを可能にすることにより、これを最小化するのを助けることができますbraslicers。しかし、多くの研究室にも効果的にスライスの生存率を維持するために必要な予防措置をvibraslicersを使用しています。考慮すべきもう一つの重要な要因は、実験を開始する前に、長い潜伏期間です。これは準備23時に発生する擾乱後のスライスにおける代謝状態およびキナーゼ活性化レベルの安定性を達成するために本当に重要であることが指摘されています。このような安定性は、長期的な録音の一貫性のために必要です。私たちは、この観察に再強調し、約3時間の長いインキュベーション時間を示唆しています。 刺激パラメータの様々なLTPを誘導することが知られているが、それぞれの場合に誘発される分子機構は（総説については38を参照）と同じでなくてもよいです。これは、順番に、シナプスタグおよび捕捉の実験の結果に影響を与えることができ、耐久性およびLTPの他の特性に影響を与えることができます。したがって、それは、刺激パラダイムと特性を検証することが重要です行う実験室の条件の下で誘発LTPのと一貫性を維持します。 我々は一般的に非常に大きなシナプス前繊維ボレーであり、最大0.5 mVの未満fEPSPsと録音も拒否されている間に繊維ボレーの大幅な変更を伴う実験で実験を考慮していません。さらに、二経路または三経路実験を実行しながら、その経路の独立性を確保することが重要です。これは、対のパルスの円滑プロトコル28を用いて行うことができます。 インターフェイス記録システムの一つの欠点は、チャンバーと周囲との温度と湿度の違いによる長時間録画時間中に電極上に凝縮液滴の形成です。これらの液滴は、慎重に時間から時間にブロットする必要があります。そうしないと液滴はスライス上に滴下し、乱れや信号のさえ喪失を引き起こす可能性があります。我々は通常、このBに取り組みますyが巧み電極に触れることなく、細い濾紙芯を用いて顕微鏡下で導かれた液滴をブロッティング。しかし、最善の解決策は、エジンバラ大学の研究者によって開発されたETCシステムとして、集中型の加熱システムを使用することです。 結びのノートでは、様々な方法論は、異なる実験の目的のために海馬スライスの調製のために使用され、世界中の研究室に存在します。手順のそれぞれは、他の上にいくつかの利点を提供しています。一つ注意深く実験の目的に適合するように、プロトコルの微細な詳細を最適化する必要があります。この記事は、STCやクロスキャプチャなど後期連想プロセスを研究するための方法論のいくつかの側面を改善するのに役立つことを願っています。

The encoding and storage of information in the brain still remains the most significant and keenly pursued challenge in neuroscience. Over the years, long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) have emerged as the leading cellular correlates of memory1,2. These activity dependent changes, which exhibit input specificity and associativity, result in the stabilization of memory traces in the neuronal networks 1,3,4. The maintenance of the two forms of synaptic plasticity requires the synthesis of plasticity-related products (PRPs)5-10. Synapse specificity that involves the interaction of newly synthesized protein only with specific activated synapses expressing LTP or LTD, is critical to memory. This specificity is explained by the concept of &#8216;Synaptic Tagging and Capture&#8217; (STC), where the PRPs interact with recently active, &#8216;tagged&#8217; synapses11,12. The STC process offers a framework for associative properties of memories at the cellular level. It provides us with a conceptual basis of how short-term forms of plasticity are transformed into long-lasting forms of plasticity in an associative and time-dependent manner13.
During the process of STC, a strong tetanization in one input that leads to protein synthesis dependent late-LTP, results in the reinforcement of a protein synthesis independent early-LTP induced in another independent input on to the same population of neurons into a persistent one13. The setting of a local synaptic tag by a transient neural activity and the synthesis of the diffusible PRPs by the strong neural activity are the two key events during STC13,14. The capture of the PRPs by the recently potentiated &#8216;tagged&#8217; synapses is fundamental to the maintenance of long-term potentiation. Many studies have been done to confirm the existence of STC phenomenon15-17 and identify the candidate &#8216;tags&#8217;18 and &#8216;PRPs&#8217;19. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) and extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2); CaMKIV, Protein Kinase M (PKM) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) are some of the candidate molecules for &#8216;tag&#8217; and &#8216;PRP&#8217; respectively19-21. The synaptic tagging model has further been expanded to include the positive associative interactions between LTP and LTD - the &#8220;synaptic cross-tagging&#8221;22. In synaptic cross-tagging, a late LTP/ LTD in one synaptic input transforms the opposite protein synthesis-independent early-LTD/LTP in an independent input into its long-lasting form or vice versa22. 
The hippocampal slice preparation is the most widely used model in the studies of long-term synaptic plasticity23,24. Much of the understanding about the concepts of synaptic tagging and cross- tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the labs are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of rat hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD for extended hours are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging23,25,26. This article describes the detailed experimental procedures for studying long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>I. Dissection Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. Bandage scissors</td>
			<td>KLS Martin, Germany</td>
			<td>21-195-23-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>B-Braun/Aesculap, Germany</td>
			<td>LX553R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Iris scissors</td>
			<td>B-Braun/Aesculap, Germany</td>
			<td>BC140R,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BC100R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Bone rongeur</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Germany</td>
			<td>14089-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Scalpel</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Germany;</td>
			<td>500236-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>B-Braun/Aesculap, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BB73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Scalpel blade#11</td>
			<td>B-Braun/Aesculap, Germany</td>
			<td>BB511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. Sickle scaler</td>
			<td>KLS Martin, Germany</td>
			<td>38-685-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7. Angled forceps</td>
			<td>B-Braun/Aesculap, Germany</td>
			<td>BD321R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8. Anesthetizing/Induction chamber</td>
			<td>MIP Anesthesia Technologies (Now, Patterson Scientific), Oregon</td>
			<td>AS-01-0530-LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>II. ACSF component chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>III. Electrophysiology Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. Microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>Model SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Temperature Controller</td>
			<td>Scientific Systems Design Inc. Canada</td>
			<td>PTC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Differential AC Amplifier</td>
			<td>AM Systems, USA</td>
			<td>Model 1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Isolated Pulse Stimulator</td>
			<td>AM Systems, USA</td>
			<td>Model 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Oscilloscope</td>
			<td>Rhode &#38; Schwarz</td>
			<td>HM0722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. Digital-Analog Converter</td>
			<td>Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK</td>
			<td>CED-Power 1401-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7. Interface Brain Slice Chamber</td>
			<td>Scientific Systems Design Inc. Canada</td>
			<td>BSC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8. Tubing Pump</td>
			<td>Ismatec, Idex Health &#38; Science, Germany</td>
			<td>REGLO-Analog</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9. Carbogen Flowmeter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>03220-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10. Fiber Light Illuminator</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries</td>
			<td>Fiber Lite MI-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11. Micromanipulators</td>
			<td>Marzhauser Wetzlar, Germany</td>
			<td>00-42-101-0000 (MM-33)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>00-42-102-0000 (MM-32)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12. Electrodes</td>
			<td>AM Systems, USA</td>
			<td>571000 (Stainless steel; 0.010, 5M&#8486;, 8 degree)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of synaptic tagging/capture and cross-capture using acute hippocampal slices from rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

記載された方法は、LTP / LTDなどのシナプスタグ付けおよび成体ラットの急性海馬スライスからのクロスキャプチャとしての連想相互作用の長期的なフォームを研究するために使用されている。23この技術は、両方のラット（Wistar系）を用いた実験のために有効であることが分かっていますマウスの様々な30,31を株。方法論は、最大8〜12時間の安定したLTP記録のために正常に使用されています。32 早期LTPの;（ 図3B、黒丸 S2）、それによって形質転換しそうでなければ減衰形（1入力（S1）の弱い強直誘発によって設定された「タグ」は、「PRPの「別の独立しているが、重複入力の強い強直誘発により誘導されるをキャプチャ長期的な1（ 図3B、白丸）にS1で-LTP）（WTETによって誘発される早期LTPの比較については20,33を参照してください ）。弱いによって捕獲のPRP強直誘発セットタグは必ずしもイキによって誘発される後期LTPから来る必要はなく、またSLFSによって誘発される後期株式会社によって提供することができます。 LTPとLTDとの間に正の連想このタイプの相互作用は、「クロスタグ付け/キャプチャ」と呼ばれています。 S1でWTET誘発性の早期LTPはS2でSLFSによって誘発される後期株式会社が提供するのPRP（ 図3C、黒丸）を捕捉することにより後期LTP（ 図3C、白丸）に強化されます。自身のベースラインと比較した場合に統計的に有意な増強またはくぼみは、両方の場合において、S1及びS2に維持された（ウィルコクソン検定、P &lt;0.05）。 が発生するタグ-PRPの相互作用のために、2つのイベント（弱前強い/強い・ビフォア・弱）の時間的順序は、二つのイベント間の時間ウィンドウは30〜60の範囲内にある限り、重要ではありません分。それはでは、第3の独立しているが、重複シナプスを含めることが賢明だろう入れて、レコーディングの安定性を監視するために、ベースラインコントロールとして使用します。 LTP / LTDの早期及び後期のフォームを誘導するために使用される電気刺激プロトコルは、STCの実験で使用する前に、一貫性と信頼性のための単一入力の実験で検証する必要があります。また、これらの実験の成功は、スライスの品質に大きく依存しているため、プロトコルに記載スライス標本の方法論の重要性を強調したいと思います。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig1.jpg" /> 海馬の解剖に使用される図1（A）ツール：（a）は、包帯はさみ（b）のアイリスはさみ（C）骨骨鉗子（d）の薄いヘラ、ソフト（E）スカルペル番号11（F）鎌状スケーラー（G）シャーレやビーカーに合わせて-bristleペイントブラシ（H）プラスチックパスツールピペット（I）ろ紙（85ミリメートル）（J）ろ紙（30ミリメートル）（k）のガラスビーカー（L）アルミ冷却ブロック（m）をペトリ皿。（B）手動組織チョッパー。 （a）は、プラットフォーム（b）は、ブレードホルダー（C）バーニアマイクロメートル、解像度10ミクロンで腕を切断。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig2.jpg" /> 図2電気生理学セットアップ（A）刺激剤からなるフィールドポテンシャルの記録のための（b）は、差動増幅器（c）は、アナログ-デジタル変換器（D）オシロスコープ（E）取得ソフトウェア（F）を有するコンピュータVibration-耐性テーブルトップ（G）&gt; 4倍の倍率（H）インターフェイス脳スライスチャンバー（I）ACSFとカーボゲン供給のための潅流システム（J）温度コントローラ（k）は、照明源（L）電極ホルダーとマニピュレータと顕微鏡。 （B）インタフェース脳スライスガラスキャピラリーに封入されたインターフェースチャンバー内のチャンバー。（C）＆（D）海馬スライス。（E）ステンレス鋼電極 ​​。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig3.jpg" /> 図3（A）フィールド電位記録用横断海馬スライスと電極位置の略図：この表現では、二つの刺激電極（S1及びS2）を刺激するためにCA1領域の放線状層中に配置された2つの独立したが、重複CA1錐体ニューロンへのシナプス入力。 2つの細胞外記録電極、頂端樹状コンパートメントからレコードフィールドEPSP（興奮シナプス後電位）に1と錐体細胞から体細胞集団のスパイクを記録するために別の体は、それぞれ放線層と層の三角骨に配置されています。 CA1-アンモン角領域1、CA3-アンモン角領域3、DG-歯状回、SC-シャファー側枝繊維、S1-刺激電極1、S2刺激電極2（B）弱いSTCを研究するための強力なパラダイムの前に：弱い強直誘発（WTET）は後期LTPを誘導するために30分でS2（黒丸）の強力な強直誘発（STET）に続く早期LTPを誘導するためのS1（白丸）に適用されます。 S1で初期LTPはタグ付けを示す後期LTPに強化され、クロスタグを研究するための強力なパラダイムの前に（N = 6）（C）弱相互作用をキャプチャします：早期LTPが続くS1（白丸）にWTETによって誘導されます30分後にSLFSを使用してS2の後半-LTDの誘導（黒丸）によります。 S1では、初期LTPは、クロスタグとキャプチャを示す6時間持続する後期LTPに変換された（n = 6）。シングル矢印は早期LTPを誘導するために適用される弱い強直誘発を表します。矢印のトリプレットを表します後期LTPを誘導するための強力な強直誘発。破線矢印はSLFSは後期LTDを誘導するための代表的なシナプスの入力に印加された時点を表します。エラーバーはSEMを示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

げっ歯類からの急性海馬スライスを用いて、シナプスタグ付け/キャプチャとクロス捕獲調査

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

investigation-synaptic-taggingcapture-cross-capture-using-acute

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K ビュー.  National University of Singapore. This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

ビデオ: Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

β-アミロイドオリゴマーの調製 1から42まで</sub海馬スライスでのシナプス可塑性の減損の>と誘導

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

神経科学

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

老化とアミロイド病理の間にシナプス変化の研究のためのラットおよびトランスジェニックマウスからの急性海馬スライスの準備

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

海馬スライス培養におけるシナプス蛋白のポストエンベディング免疫金ラベリング

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

培養海馬神経細胞のシナプス小胞エンドサイトーシスを測定

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

海馬の齧歯動物の脳スライスにおけるシナプス密度の評価

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.