サイバー生成は、任意の新規ミトコンドリアDNA変異の病原性役割を理解し、アトリプラズムの割合を疾患の重症度と相関させるための最先端のプロトコルです。この技術は、患者の核背景の寄与が存在しない均質な核系において生化学的調査を行うことを可能にする。この技術は、ミトコンドリアDNAの変異の病原性を検証することを可能にする。
生化学的レベルでその影響を研究することを可能にする カルシウムおよびマグネシウムを含まない2ミリリットルの1X PBSを使用して、線維芽細胞を含む35ミリメートルの皿を2回洗浄する。70%エタノールで皿の外表面をきれいにし、アルコールが蒸発するまで待ちます。蓋を皿から、スクリューキャップをボトルから取り外します。
蓋のない各ディッシュを上下逆さまにして、各250ミリリットルの遠心ボトルの底に置きます。各ボトルに32ミリリットルの核生成培地をゆっくりと加え、培地が皿に入り、細胞と接触できるようにします。長いガラスの牧草地のピペットを使用して皿から泡を取り除き、先端をブンセンの炎で湾曲させます。
各ボトルをスクリューキャップで閉じ、遠心分離機に移します。37°Cで20分間遠心分離し、8, 000 x G.ボトルから培地を吸引し、それを捨てる。以前に70%エタノールを噴霧した滅菌ガーゼの上のボトルを反転させて皿を取り除きます。
皿の外面とその蓋を70%エタノールできれいにし、エタノールが蒸発した後に皿を閉じます。先に進む前に、生細胞について倒立顕微鏡を用いて細胞芽細胞形成の確認を行う。サイトカラシンによって誘導されるそれらの核の押し出しのために非常に細長い線維芽細胞を探してください。
各35ミリメートルの皿に1,000,143行のゼロセルを追加します。5%FBSを添加した2ミリリットルの培養液に再懸濁した。皿を加湿二酸化炭素インキュベーターに3時間放置して、幽霊の143行のゼロ細胞を沈降させます。
3時間のインキュベーションの後、培地を吸引して廃棄する。付着細胞を血清またはMEMを含まない2ミリリットルのDMEM高グルコース培地で2回洗浄し、次いで培地を吸引して廃棄する。500マイクロリットルのポリエチレングリコール溶液を細胞に加え、正確に1分間インキュベートする。
ポリエチレングリコール溶液を吸引し、廃棄する。血清なしまたはMEMで2ミリリットルのDMEM高グルコースで細胞を3回洗浄する。2ミリリットルの融合培地を加え、5%の二酸化炭素で摂氏37度のインキュベーター内で一晩インキュベートする。
残りの培養皿中の細胞をトリプシン処理する それらを数えて1つ以上のペトリ皿に播種する クローンが現れるまで補充培養物に皿あたり50〜100個の細胞を加える。それから数日間成長させてください。実体顕微鏡を使用して、クローニングシリンダーまたはピペットチップを備えたペトリ皿からクローンをピックアップします。
異なるクローンをプールすることを避け、各ウェルに200マイクロリットルの補充培養培地を含む96ウェルプレートに移すようにしてください。サイブリッドは、ミトコンドリアミオパチー、脳症乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソードに関連する最も一般的なミトコンドリアDNA変異の1つであるヘテロプラズムM2343A2Gを保有する患者由来の線維芽細胞から生成した。可変数のタンデムリピートの分析は、サイバーDNAが、患者のサイバーDNAを143Bゲノムで置換することを確認する行ゼロ細胞と同一であることを示した。
制限断片長多型、またはシーケンシング分析は、ミトコンドリアDNA変異の存在およびヘテロプラスミーパーセンテージを評価するために使用することができる。このプロトコルを試みるときは、核子およびミトコンドリアDNAの正しい遺伝的資産、ならびに再移入されたサイブリッド中のミトコンドリアDNA量を検証することが重要である。
