このビデオでは、小分子を標的とするRNAの存在下で目的のRNA配列の二次構造を決定するためのインビトロ形状実験のための詳細なプロトコルを提供します。in vitro形状は、通常200ヌクレオチド未満であるアミノサイズのRNA要素上の各ヌクレオチドのダイナミクスを理解するための費用対効果の高い方法である。原稿に記載されたRNAテンプレートを調製した後、ラジオラベル逆転写プライマーはγ32P ATPを添加することにより、逆転転写プライマーを添加する。
10XPNK反応バッファー、ポリヌクレオチドキナーゼおよびRNAの遊離水を1.7ミリリットルマイクロ遠心分離チューブで合計容量20マイクロリットルで。その後、摂氏37度で1時間インキュベートします。その後、摂氏65度から20分間サンプルを活性化し、脱塩カラムと遠心分離機のサンプルを1000倍のG.2XTBE尿素サンプルバッファーとミックスで25マイクロリットルを加えて混合します。
これらの標識された製品を10%アクリルアミドゲルに下げ、放射能を上の貯水池に出血させないようにしてください。ゲルを1時間20ワットで実行します。実行後、ゲルカセットのガラス板を取り外します。
ラップの部分にゲルを置きます。プラスチックをゲルの上部に折り畳んで、気密サンドイッチを作ります。ゲルサンドイッチをカルシウムタングステン酸蛍光体スクリーンに置き、想像する器具で露出させます。
ゲルのエッジがどこにあるかを知るために、規則的な光でゲルを再びイメージします。画像処理ソフトウェアを使用して 2 つのイメージをオーバーレイし、明るい画像と暗いイメージをオーバーレイします。次に、両方の画像を同時に表示するために、上の画像をわずかに不透明にします。
印刷された画像のサイズが実際のゲルと同じであることを確認します。次に、印刷された画像にゲルを合わせます。最後に、滅菌されたカミソリの刃を使用して、ゲルから所望のベンドを切り取り、ゲルの各部分を別々の1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離管に入れる。
受動溶出によりゲルスライスからDNAを回収するには、各1.7ミリリットルチューブに溶出沈殿ミックスを0.3ミリリットル加えます。摂氏4度の放射性安全容器にチューブを摂氏4度で16時間インキュベートします。インキュベーション後、液体を新しい1.7ミリリットルチューブに移します。
2.5倍の氷冷200プルーフエタノールを加え、チューブを6回反転して液体を混ぜます。最低1時間はマイナス80°Cでチューブをインキュベートします。10,000gと摂氏4度で10分間遠心した後、ピペットで上清を慎重に取り除きます。
80%エタノールを1ミリリットル加え、ペレットを洗浄します。渦は15秒間、遠心分離機は同じ条件下で再び。ピペット処理により上清を除去した後、DNAペレットを5分間空気乾燥する。
50マイクロリットルのRNAのフリーウォーターを加え、上下に10回ピペットで混ぜます。シンチレーションカウンターで1マイクロリットル当たり約100,000カウントにDNA濃度を正規化します。化学修飾のために4つのサンプルを調製するには、0.5 XTEバッファーの32マイクロリットルにRNAの8ピコモールを1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離管に加えます。
摂氏80度で2分間加熱し、氷の上で少なくとも1分間冷やします。次に、5倍の折りたたみミックスの8マイクロリットルを追加し、このRNA混合物の9マイクロリットルを4つのPCRチューブのそれぞれに割り当て、1から4まで標識します。10%DMSOの1マイクロリットルをチューブ1つとしてマークしたチューブに加え、濃縮された小分子溶液を1マイクロリットルのチューブ2に、希釈された小分子溶液をチューブ3に1マイクロリットル、チューブ4に1マイクロリットルの水を加えます。
サーマルサイクラーで37°CのすべてのPCRチューブを30分間インキュベートします。2つの素数OH改質反応の直前に、2つのモルナイストック溶液の1マイクロリットルをDEPC処理水の3マイクロリットルで希釈し、0.5モル加工溶液を生成します。すぐにチューブ1、2、3にこの溶液の1マイクロリットルを追加します。
チューブ4に25%DMSOの1マイクロリットルを加え、摂氏37度のサーマルサイクラーで15分間インキュベートします。新鮮な1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブを4個用意し、各チューブに100マイクロリットルの溶出沈殿ミックスと2マイクロリットルのグリコーゲンを加えます。次に、これらのチューブのそれぞれに、対応するPCRチューブからすべての液体を移動します。
各チューブに0.34ミリリットルの氷冷200プルーフエタノールを加え、5秒間渦を混ぜて混ぜます。チューブをマイナス80度の冷凍庫に少なくとも1時間置きます。その後、チューブを摂氏4度で14,000倍Gで15分間遠心分離します。
RNAペレットを邪魔することなく、各チューブから上清を除去します。1チューブあたり80%エタノールの0.5ミリリットルを加え、RNAペレットと渦を15秒間洗浄します。同じ条件で再び遠心分離した後、上清を取り除き、RNAペレットを5分間空気乾燥させます。
RNAの無料の水とパイプの9マイクロリットルを加え、上下に10回混ぜます。変更したRNAを4つの新しいPCRチューブに移し、前のステップのように1~4個のラベルを付けます。7マイクロリットルのDEPC処理水にRNAの2つのピコモールを4つの追加PCRチューブのそれぞれに追加し、5〜8の番号でそれらをラベル付けします。
回収された放射性標識プライマーの2マイクロリットルを、1~8個のPCRチューブのそれぞれに加えます。摂氏65度で5分間加熱した後、サーマルサイクラーですぐに摂氏4度まで冷却します。5x RTバッファーの4マイクロリットル、0.1モルDTTの1マイクロリットル、および各チューブにDNTPミックスの1マイクロリットルを追加します。
その後、チューブ1〜4にDEPC処理水の2マイクロリットルを追加します。チューブ5に5ミリモルddATPの4マイクロリットル、5ミリモルddTTPの4マイクロリットルをチューブ7と5ミリモルddGTPの1マイクロリットルに加え、5ミリモルdGTPの1マイクロリットルとDEPC処理水の3マイクロリットルをチューブ8とピペットを4回混合します。サーマルサイクラーでPCRチューブをすべて摂氏52度で1分間加熱した後、各チューブに1マイクロリットルの逆転写酵素を加え、上下に4回パイプして混合します。
サーマルサイクラーで20分間摂氏52度で反応をインキュベートします。RNAを加水分解するには、5つの水酸化モルナトリウムのマイクロリットルを各チューブに加え、摂氏95度で5分間加熱します。次に、1モル塩酸の5マイクロリットルを加えて反応を中和し、先に述べたようにエタノール沈殿を繰り返す。
DNAペレットを5分間空気乾燥させた後、1.7ミリリットルチューブに10マイクロリットルの水と10マイクロリットルの2xTBE尿素サンプルローディングバッファーを加え、10回上下して再溶解します。サンプルを摂氏70度で5分間加熱し、チューブを氷の上に置いてからゲルにセットします。氷上に置かれたサンプルの10マイクロリットルを8%ポリアクリルアミドシーケンシングゲルにロードします。
65ワットで2時間、または底染料がゲルの3/4に達するまでゲルを実行します。スペーサーを取り外し、ヘラをそっと挿入して、上のシリコンガラス板を取り外します。大きなフィルターペーパーでゲルを覆い、ゲルが濾紙に付着するように軽く押します。
下端から始めて、フィルターペーパーを持ち上げ、紙と一緒にガラス板からゲルを取り除きます。以前のようにゲルを包装紙に移した後、真空で摂氏70度で1時間乾燥し、ゲルと乾燥機の間に複数のフィルターペーパーを使用してください。ゲルサンドイッチを写真漂白蛍光体保存スクリーンカセットに移し、ゲルの放射能を4~16時間画面に露出させます。
最後に、蛍光体記憶装置を撮像装置に設置し、約30分間、中解像度でスキャンします。ポリアクリルアミドシーケンシングゲルを蛍光体貯蔵画面に露出させた後、成功した形状実験はゲルの上部に単一かつ最も強い曲げを示し、スミアなしの一塩基分解能でゲル全体に曲がった。ゲルはまた、いくつかの曲げの強度が小分子の存在下で変化したことを示し、塩基対強度の変化を示した。
ページ分析の一般的な問題は、塩の前部として知られているスミア領域がゲルの真ん中に現れる可能性があり、おそらく高濃度の塩、DMSOまたは負荷サンプル内の他の不要な物質が原因である。すなわち、エタノール沈殿により不要物質を除去することで回避できる。同種のRNAテンプレートは、インビトロ形状に好ましい。
5つの素数と3つの素端の両方でリボソームを使用して、そのようなRNAを得る。細胞内の形状はまた、細胞コンテキストにおけるRNA二次構造を得るために行うことができる。インビトロ形状は、生体内RNA結合タンパク質相互作用を再現しない場合があります。
インビトロ形状は、低分子の存在によるRNA構造の変化を検出するための強力な方法です。これは、逆転写酵素停止のパターニング強度の変化を定量化することによって行われる。このビデオに記載されているすべての実験は、適切な個人保護とプレキシガラスシールドを備えた認可された放射性職場で行われることに注意してください。
