このプロトコルは、堅牢で信頼性が高く、効率的で手頃な価格であることが証明されたタンパク質-核酸相互作用の研究のためのビオチン標識プラットフォームを提供します。ビオチン標識核酸の同じバッチを長期間にわたって使用することができ、実験の再現性を維持する。最後に、ここで説明するすべてのビオチン標識アッセイは1日以内に実行でき、特別な装置を必要としません。
この手順のデモンストレーションは、当研究室の大学院生であるリナ・ユーです。MEIOBおよびMOV10の構造を準備し、適切な細菌に変える。MEIOBを抽出するには、遠心分離を介して細胞をペレットし、氷冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、またはDPBSバッファーの20ミリリットルでそれらを再懸濁します。
氷の上の細菌の懸濁液を超音波処理します。次いで、12,000回gと摂氏4度で15分間の遠心分離し、上清を新鮮なチューブに移します。グルタチオン-セファローズビーズを洗い流し、摂氏4度で2時間培養します。
750倍gと4度でビーズをペレット化するために1分間遠心分離します。10ミリリットルの氷冷PBSでビーズを8回すすいでください。次に、溶出バッファーを1ミリリットル加え、ビーズを摂氏4度で10分間インキュベートし、遠心分離を介してビーズを溶出させます。
溶出を6回繰り返し、6つの分数を一緒にプールします。溶出したタンパク質を遠心フィルターに移し、100〜200マイクロリットルの最終体積に対して7、500倍gの遠心分離によって濃縮する。MOV10を抽出するために、原稿の指示に従ってHEK293T細胞およびペレット細胞でタンパク質を発現させる。
完全なEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルで3ミリリットルの細胞ライシスバッファーでペレットを再懸濁し、氷の上で30分間インキュベートします。その後、摂氏4度でリセートを遠心分離します。K150バッファーで2回洗浄して、アンチフラッグの磁気ビーズを調製します。
洗浄後、ビーズを氷冷K150バッファーの1ミリリットルに再び懸濁し、穏やかな回転で摂氏4度で2分間インキュベートします。磁石にビーズを集め、上清を取り除きます。ビーズを細胞のライセートに加え、摂氏4度で2時間インキュベートします。
原稿の方向に従ってK150バッファーでビーズを洗浄し、FLAG溶出バッファーの300マイクロリットルにビーズを再懸濁します。ビーズを磁石の上に置き、MOV10タンパク質を用いて上清を集め、タンパク質濃度を決定します。各オリゴを20マイクロモルに希釈し、それらをアニールして原稿の指示に従ってRNA二重鎖を形成して、RNAオリゴヌクレオチドを調製します。
MEIOB電気泳動移動性シフトアッセイ(EMSA)の場合は、原稿の指示に従って試薬を混合します。20マイクロリットルの最終的な反応量のための水を加える。反応を室温で30分間インキュベートし、次いで5倍の停止バッファーを加えます。
MOV10ヘリケース活性アッセイの場合は、原稿の指示に従って試薬を混合し、20マイクロリットルの最終的な反応量のために水を加えます。37°Cで10分、30分、60分間インキュベートし、5倍の停止バッファーを加えて反応を停止します。次いで、20%天然ポリアクリルアミドゲルを調製し、各サンプルの20〜25マイクロリットルを各ウェルに負荷します。
ブロモフェノールブルーマーカーがゲルの下部4分の1に移行するまで、氷浴の100ボルトでゲルを実行します。アクリルアミドは有害で有毒です。適切な個人用保護具で処理することが重要です。
ゲルプレートを分解し、ローディングウェルと未使用レーンを除去してゲルをトリムします。ゲルを 0.5x TBE バッファーに入れます。フィルターペーパーとナイロン膜をゲルの大きさにカットし、紙と膜を事前に濡らし、スタックを組み立てて転写します。
90ミアンペアで半乾燥電気泳動装置でゲルから膜にサンプルを20分間移します。次いで、45〜60秒間、120ミリジュール/センチメートルで膜を照射することにより、試料を架橋する。化学発光検出のために、20ミリリットルのブロッキングバッファーを膜に加え、穏やかに振りながら15〜30分間インキュベートします。
ブロッキングバッファーを慎重に取り外し、コンジュゲート/ブロッキング バッファーに置き換えます。膜を15分間再びインキュベートします。1回の洗浄で5分間振りながら、膜を4回洗います。
次いで、膜に30ミリリットルの基質平衡バッファーを加え、20〜25rpmで振りながら5分間インキュベートする。膜の表面全体を基質の作業溶液で覆い、5分間インキュベートします。インキュベーション後、化学発光イメージングシステムで膜を1〜3秒間スキャンします。
MEIOBタンパク質A、C、およびEの精製は、クマシーブルー染色およびウェスタンブロット分析で検証することができます。赤い矢印は、精製されたMEIOBタンパク質の位置を示す。MEIOBと一本鎖DNAの相互作用は、EMSAを用いて可視化することができる。
濃度依存性結合および切断が観察される。予想通り、変異体MEIOB-EとMEIOB-CはDNAと相互作用しないが、野生型のMEIOB-AだけがDNAと相互作用する。MEIOBと一本鎖RNAの相互作用も観察できる。
野生型MEIOBは、一本鎖RNAに対する濃度依存的結合およびエキソヌクレアーゼ活性を示す。しかし、定量比較は、MEIOBがRNAよりも高い効率でDNAを結合することを示している。MOV10の精製は、クマシーブルー染色で検証され、タンパク質のヘリカゼ活性を5素数のオーバーハングを有するRNAデュプレックスで測定した。
反応時間が長くなるにつれて、MOV10は徐々に二本鎖RNAを巻き戻します。アッセイのコストを削減するために、化学発光検出は、検出キット試薬の2倍希釈または自作試薬を用いて行うことができる。ここで説明するプロトコルは、EMSAなどのインビトロ生化学アッセイやビオチンが一般的に使用されていない酵素反応の基質としてビオチン標識核酸を使用しました。
