このプロトコルは、安全、簡単、効果的な方法で複数の眼組織に遺伝子治療を送達する方法を提供します。また、小動物の間質内および網膜下注射にも適応可能です。結膜下注射経路の使用は最小限の侵襲性である。
リスクが少なく、複数の眼疾患を治療するためのAV配信に大きな期待が寄せられています。世界中で10億人以上が視覚障害に苦しんでいるため、安全で簡単な方法で薬物送達を行うことで、さまざまな失明の原因の治療に幅広く適用できます。このプロトコルに記載されている遺伝子送達方法は、潜在的な介入戦略を開発し、最終的にこれらの薬を患者に送達する眼科医を実践している人々にとって特に興味深いものです。
このプロトコルを初めて実行する人にとっての最大の課題は、おそらく結膜腔の概念に針を挿入することです。まず、実体顕微鏡とシリンジポンプをバイオセーフティキャビネットに入れて注入システムを組み立てます。次に、ポリエチレンチューブを約50センチの長さにカットします。
36ゲージの針の端をチューブの一方の端に挿入します。次に、使い捨ての3ミリリットルシリンジに滅菌水を入れ、針の反対側のチューブの側面に挿入します。滅菌水と70%アルコールを交互に3回洗い流してチューブを消毒し、チューブ全体に漏れ、詰まり、損傷がないことを確認します。
使い捨ての3ミリリットルシリンジを使用して、チューブに滅菌水を満たし、チューブを使い捨てシリンジに取り付けたままにします。次に、バイオセーフティキャビネットの表面にパラフォームを置き、それに滅菌水のプールを追加します。針に接続されているチューブの部分を滅菌水のプールに沈めます。
次に、使い捨てシリンジをチューブ開口部から引き出して、シリンジを取り外したときにチューブシステムに空気が入らないようにします。次に、10マイクロリットルのハミルトンシリンジに滅菌水を入れます。次に、ハミルトンシリンジの針先をパラフィルム上の滅菌水のプールに沈めて、ハミルトンシリンジ針をチューブの開放端に接続します。
ポンプ画面の高速リバースボタンを押したままにして、プッシャーブロックをシリンジのおおよその長さに移動します。次に、ブラケットclを緩めますampノブを緩めて、プッシャーとシリンジホルダーブロックの保持ブラケットを緩めます。その後、ハミルトンシリンジをシリンジホルダーブロックにロードし、製造元の指示に従ってシリンジを固定します。
ポンプ設定画面でパラメータを調整するには、フォース」ボタンを押してフォースレベルを30%に設定し、変更を受け入れて設定画面に戻ります。クイックスタート」ボタンを押し、[方法]を選択してから、[注入のみ]オプションを選択します。シリンジオプションについては、ハミルトン1700を選択し、次にガラス「そして10マイクロリットルを選択します。
後で、注入速度と注入量を選択します。Infuse」ボタンを押して、チューブと注射針を水でいっぱいにしたまま、ハミルトンシリンジから水を排出します。次に、注射針をウイルスストックのアリコートに入れてウイルスを回収します。
次に、リバースボタンを押してハミルトンシリンジを少し引き戻し、チューブに小さな気泡を導入します。動物を麻酔した後、鉗子で結膜をつかみます。次に、ベベルが結膜で完全に覆われるまで針を結膜に挿入し、針を地球に当てます。
同時に、フットスイッチを使用してスタートボタンを押して注射を開始します。AAVベクターの分布を調べるために、眼および周辺組織をヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。代表的な矢状切片は、インドインクの分散が主に眼周囲の緩い結合組織の強膜の外面の外眼筋に隣接して発生することを示しました。
注射後8週間での自己相補的AAV8の形質導入を確認するために、断面中の緑色蛍光タンパク質存在量を免疫蛍光染色により調べた。その結果、AAV8ベクターは眼後方の眼周囲筋と角膜を効率的に形質導入することが明らかになりました。ベクターの生体分布を解析するために、肝臓や心臓を含む他の臓器のベクターゲノムコピー数と明確な眼のコンパートメントを、導入遺伝子に特異的なプライマーとプローブを使用した定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって調べました。
導入遺伝子の発現は定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により確認され、AAV8の結膜下注射により眼瞼、結膜、角膜、視神経に導入遺伝子が発現することが示唆された。気泡は、チューブ内の水と治療薬の間のバリアとして機能します。この技術により、他の研究者は、複数の疾患に対する眼科溶液と眼遺伝子治療の両方に対する結膜下投与経路の使用を探求することができます。
