We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and M&#233;lissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to St&#233;phane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.

本研究で用いたすべての動物は、眼科と視覚研究における動物の使用に関するARVO声明によると世話と取り扱った。 HEK-293細胞17,18の一過性トランスフェクションによる組換えAAV（rAAVの）1。生産注：マクルーアC、Joveの（2011）19を参照してください。 <ol><li> AAVベクタープラスミドの大規模プラスミド調製を（少なくとも1 mg / ml）で精製する。 3プラスミドを使用してください。 AAV逆方向末端ことなく複製およびキャプシド遺伝子を保有するAAVヘルパープラスミドは、ITRは、AAV ITRを保有する導入遺伝子発現カセットは、転写プラスミドと呼ばれる、プラスミド、アデノウイルスヘルパー遺伝子の供給E2、E4、およびVA RNA遺伝子と呼ば繰り返すpHELPERとしての。 </li><li>ポリエチレンイミン（または他のトランスフェクション試薬）を用いて、これらの3つのプラスミドで293細胞をトランスフェクション。トランスフェクション効率の80％を超える良好なv​​iのために必要であるRAL利回り。 </li><li>イオジキサノール勾配で293細胞溶解物から組換えAAVを精製する。 15％、25％、40％、60％イオジキサノール勾配を得るために使用される。 、AAV粒子を含む40％イオジキサノール画分を収集し、1時間50万×gで超遠心分離した後に一部を集中し、0.001％プルロニックを含むPBS（リン酸緩衝生理食塩水）に対するバッファー交換。 </li><li>ウイルスゲノム力価20を決定するには、QPCRに続くDNA分解酵素プロテイナーゼダイジェストを行う。順方向および逆方向プライマーはAAV2 ITRに位置して62 bpの領域を増幅する。プラスミド標準のために、プローブは、FAMで標識し（BHQ）、ブラックホールクエンチャーを有している。 </li><li> ITRプライマー、100nMのフォワードITRプライマー、100nMのAAV2 ITRプローブ、0.4mMのdNTPを、2のMgCl 2、1×プラチナTaqポリメラーゼ緩衝液、1Uプラチナリバース340 nMのを使用して25μlの最終体積で定量PCR（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）を行うTaqおよび5μlのテンプレート（標準、サンプルおよび鋳型なしコントロール）。 </li><li>のために標準は、7×10倍連続希釈（5μlの10月10日から4月 10日までのゲノムの/ mlの最終濃度とした2×10 9 3 2×10ゲノム/ mlのそれぞれ）でのトランスフェクションのためのプラスミドを使用する。 </li><li> 1分で1分間の60℃でのアニーリング/伸長のために95℃での変性を40サイクル、続いて15分間95℃での初期変性ステップでプログラムを開始する。短期保存または長期保存期間のために-20℃で、4℃で保存する。 </li></ol> AAVの2.硝子体内注射<ol><li>ケタミン（50mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）でC57BL6Jマウスを麻酔し、正向反射の消失、適切な麻酔を示す引っ込め反射とテールピンチ応答を確認する。 neosynephrine 5％の角膜アプリケーションによって生徒を拡張し、点眼薬0.5％mydriaticum。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。 </li><li>超微細な30のG disposabを渡すル赤道を通じて針と硝子体腔に、角膜縁の隣に（チウK、Joveの（2007年）21を参照）。硝子体腔（ 図1）の中央に針の直接観察にShH10-GFPまたはAAV5-GFPの1 11 10×4のVPを含む1μlの株式を注入。 ILM実験のコントロールとして片目を使用してください。 BRB実験のために両眼を注入。注入された目に​​、抗炎症、抗菌局所的処置を適用します。 </li><li> neosynephrineで生徒を拡張し、mydriaticum目は、撮影のために低下する。 GFP（緑色蛍光タンパク質）の発現は1週間、2週間、1ヶ月、および硝子体内注射後2ヵ月（ 図1）に従うように眼底カメラを眼底検査を行う。 CO 2吸入1から2ヶ月後に注射することによってマウスを生け贄に捧げる。 </li></ol> 3.免疫組織化学<ol><li>網膜凍結切片（ 図1）の場合は、Lを削除するには除核の目を解剖1時間、4％パラホルムアルデヒド中ではens角膜、浸漬修正。 <ol><li>室温で1時間、室温でさらに時間を20％スクロース、10％スクロース中で、以前に固定目をCryoprotect。一晩4℃で30％スクロース溶液中でCryoprotect。フリーズとそのようなクライオマトリックスとして樹脂を埋め込んでアイカップを埋め込む。 10μmの凍結切片を作成し、特別に凍結組織切片のために処理したスライドにマウントし、それは、染色中に組織の密着性を向上。 </li><li> 5分間PBS（pH7.4）中の0.1％トリトンX100を持つセクションを透過。洗浄PBSで2回、1％BSA、0.1％ツイーン20を含むPBS中で室温で1時間ブロック。 </li></ol></li><li>網膜のフラットマウント（ 図1）は、切開を容易にするために、15分間、4％パラホルムアルデヒド中で除核目を固定する。 <ol><li> 15〜30分で、角膜とレンズを削除するには、目を解剖。鋸状縁を中心に切断することにより、網膜色素上皮（RPE）と強膜から網膜を分離し、視神経。網膜と形質導入網膜細胞における蛍光タンパク質を（固定が24時​​間を超えてはならない）を固定するためにさらに30分間4％パラホルムアルデヒド中に浸し。滅菌PBS、pH7.4の中で5分間洗浄する。 </li><li> （1％BSA、2％正常ヤギまたはロバ血清を含むPBS、0.5％トリトンX-100）を、ブロッキング緩衝液をPBSに変更し、室温で4時間または4℃で一晩のいずれかのために、ブロッキング緩衝液中でインキュベートする。 </li></ol></li><li>室温または4℃で一晩のいずれか4時間、ブロッキング緩衝液中で一次抗体を有する組織をインキュベートする。 PBSで洗浄3X。 注：次のように使用される抗体は、以下のとおりです。抗ラミニン（1 / 1,000）ILM、抗ロドプシンクローン4D2（1/500）ラベリングロッド、抗グルタミンシンテクローンGS-6（1/1500）ラベリングミュラー細胞を標識し、PNAレクチン（1/40）ラベリングコーン。 </li><li>部屋テンペで1時間（凍結切片）または2時間（フラットマウント）用のブロッキング緩衝液中でアレクサフルオロ結合二次抗体の1：500希釈を有する組織をインキュベートrature、光から保護。 PBSで洗浄3X。 </li><li>網膜に切り込みを緩和行い、感光体または網膜神経節細胞（RGC）どちら側が上方に向けてスライドガラス上にflatmount。 4℃でカバーガラスとストアを適用し、水性のmountingmediumを追加します。 </li><li>レーザー走査型共焦点顕微鏡上で、共焦点顕微鏡を実行します。励起および発光のクロストークを低減するために、順次行ずつ画像を取得する。ナイキスト - シャノンのサンプリング定理によるとステップサイズを定義する。最終画像で過飽和のピクセルを最小限に露出設定を使用してください。 Zプロジェクトの機能の下に最大強度を使用して、最終的に8ビットRGBカラーモードに変換する単一平面上FIJIとプロセス12ビット画像、プロジェクトZ-セクション。 </li></ol>マウスの血液サンプルの4 PCR分析<ol><li>麻酔しC57BL6Jマウスの陰茎静脈にAAV-GFPの1〜10×4の11粒子を含有する100μlの株式（イソフルランの5％を注入超微細6mmの針をインスリンシリンジを用いて閉鎖室で誘導手術中、ノーズコーンを介してイソフルランの2.5％）である。この動物は、AAV粒子の循環の陽性対照として役立つ。 </li><li>注射と3時間、24時間、2日、3日ShH10硝子体内注射後またはintrapenile注射（ 図1）前後のマウスの尾からのサンプルの血液。約10〜20μlをヘパリンチューブに回収される。手続きの完了後にCO 2吸入によりマウスを生け贄に捧げる。 </li><li>お好みの抽出キットを用いて血液サンプルからゲノムDNAを抽出します。 </li><li>ゲノムDNAのPCR増幅を行う。このプロトコルの以下のプライマー対を使用します。GFPを、5&#39;-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 &#39;、アンチセンス5&#39;-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3&#39;を感じる。以下のPCRプログラムを実施した：95℃で2分（1サイクル）。 95℃45秒、55℃1分、72℃45秒（30サイクル）; 72℃5分（1サイクル）;4℃の保持。 </li></ol> 5.オプションエバンスブルー法注：エバンスブルー法10を用いて、網膜に血管からのアルブミン漏出を測定することにより、血管透過性を定量化する。 <ol><li> 5μmのフィルターを介して生理食塩水（6 mg / ml）で、超音波洗浄器で5分間超音波処理し、ろ過に溶解してエバンスブルー色素を準備します。 </li><li> （イソフルラン吸入、ステップ4.1を参照）C57BL6Jマウスを麻酔、適切な麻酔を示す引っ込め反射とテールピンチ応答を正向反射の消失を確認し、陰茎静脈（ 図1）を介した（45mg / kg）のエバンスブルーを注入する。マウスの足、銃口、耳は色素の取り込みと分布を確認し、エバンスブルー注射後、明らかに青になっていることを確認してください。 </li><li>ケタミン（50mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）での色素の注射後C57BL6Jマウスに3時間を麻酔しrightinの消失を確認適切な麻酔を示すGレフ。サンプルヘパリンチューブ中に血液を心臓内に約500μlのクエン酸塩緩衝液を用いて、左心室を介して2分間、マウスを灌流（0.05 M、pHを3.5;蒸留水1 Lクエン酸7.8gのクエン酸ナトリウムを3.8g溶解）血管収縮を防止するために、37℃に予め温めておいた。マウスは、灌流を経由して屠殺する。 </li><li>慎重に灌流、脱核とした後に網膜を収集するための手術用顕微鏡の下で両眼を解剖（3.2項を参照）。遠心エバポレーターで乾燥網膜は一晩中、重さ、および（100 XG）しながら65℃で18時間ホルムアミド100μlの網膜をインキュベートすることにより、エバンスブルー色素を抽出します。 4°Cで15分間20,798.5×gで4℃で遠心分離血液サンプルで2時間20,798.5×gで30Kオメガフィルタチューブ内の遠心網膜サンプル。 </li><li>吸光度を測定するために、両方の上清を使用してください。 foの最大吸光度を差し引くことにより、各試料の吸光度を決定する740 nmでの吸光度を最小に620nmの青色rのエバンス。ホルムアミド中のエバンスブルーの標準曲線から血漿および網膜のエバンスブルー濃度を計算します。時間当たりの乾燥網膜（血漿/ gの網膜の乾燥重量/時ずつ）のグラムあたりのエバンスブルーのマイクロリットルでBRB透過性を発現する。 </li></ol> 6.オプションフルオレセイン血管造影注：マウスにおける網膜血管からの漏出は、フルオレセインナトリウムの腹腔内注射することによって可視化することができる。 <ol><li> （neosynephrineとmydriaticum）をドロップしC57BL6Jマウスを麻酔（イソフルラン吸入、 ステップ4.1を参照）、目で瞳孔を拡張。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。 </li><li>フルオレセイン血管造影用の0.1ミリリットル滅菌生理食塩水で10％フルオレセインナトリウムの腹腔内に0.01〜0.02ミリリットルを注入。 </li><li>眼底カメラを用いて、注射後両目の画像を収集する。プロの後にCO 2吸入によりマウスを生け贄に捧げるcedure。 注：網膜の血管は血管造影に見えるようになるために20秒が必要です。画像は、フルオレセイン注射後3-10分最大の間に捕捉されなければならない。漏洩スポット（存在する場合）は2.5分後に観察可能である。後の時点で、画像品質がフルオレセインナトリウムまもなく分析のために使用された後に得られた硝子体、こうして画像のみに拡散するために失われる。 </li></ol>

<ol>
	<li>Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+retinal+basal+lamina+during+early+embryonic+development+leads+to+a+retraction+of+vitreal+end+feet,+an+increased+number+of+ganglion+cells,+and+aberrant+axonal+outgrowth.">Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth.</a> J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).</li><li>Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+disruption+of+the+retinal+basal+lamina+and+its+effect+on+retinal+histogenesis.">Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis.</a> Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).</li><li>Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane-dependent+survival+of+retinal+ganglion+cells.">Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).</li><li>Abdelkader, E., Lois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+limiting+membrane+peeling+in+vitreo-retinal+surgery.">Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery.</a> Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).</li><li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+limiting+membrane+barriers+to+AAV-mediated+retinal+transduction+from+the+vitreous.">Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous.</a> Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">Muller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+release+by+retinal+glia+depends+on+both+oxygen+and+glucose+supply.">VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply.</a> Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).</li><li>Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-retinal+barrier+in+hypoxic+ischaemic+conditions:+basic+concepts,+clinical+features+and+management.">Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management.</a> Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).</li><li>Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+response+of+neurons+and+glial+cells+to+hypoxia+in+the+retina.">Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).</li><li>Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+blood-retinal+barrier+breakdown+quantitation+using+Evans+blue.">Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).</li><li>Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Yang, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-mediated+transduction+of+murine+retina+with+adeno-associated+virus:+effects+of+viral+capsid+and+genome+size.">Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size.</a> J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+following+subretinal+AAV5+vector+delivery+is+not+affected+by+a+previous+intravitreal+AAV5+vector+administration+in+the+partner+eye.">Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye.</a> Mol Vis. 15, 267-275 (2009).</li><li>Koerber, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+adeno-associated+virus+for+enhanced+glial+gene+delivery.">Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery.</a> Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).</li><li>Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+adeno-associated+viral+variant+for+efficient+and+selective+intravitreal+transduction+of+rat+Muller+cells.">A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells.</a> PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).</li><li>Vacca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+gene+delivery+in+Dp71-null+mouse+model+with+compromised+barriers.">AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers.</a> Glia. , (2013).</li><li>Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).</li><li>Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+use.">Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use.</a> Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348 (2011).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreous+injection+for+establishing+ocular+diseases+model.">Intravitreous injection for establishing ocular diseases model.</a> J Vis Exp. (8), 313 (2007).</li><li>Kolstad, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery+in+retinal+degeneration.">Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration.</a> Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).</li><li>Sene, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implication+of+Dp71+in+osmoregulation+and+vascular+permeability+of+the+retina.">Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina.</a> PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).</li><li>Benard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Quantifiable+Blood+Retinal+Barrier+Breakdown+Model+In+Mice.">A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice.</a> ARVO Annual Meeting. , (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

BRBは、血液および網膜の間の分子の交換を調節する。その内訳は、糖尿病性網膜症または加齢性黄斑変性症（AMD）などの種々の疾患と関連している。我々は最近、透過BRBを表示ジストロフィンノックアウトマウスにおいて、網膜は、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）によって媒介される遺伝子送達に対してより寛容になることを示した。しかし、BRB透過性AAV粒子にもかかわらず、眼内に、...

ミュラー細胞は網膜の主要なグリア要素である。形態学的には、彼らが放射状に網膜にまたがるとそのエンドフィートは、硝子体に接触して、ILMと後者の秘密のコンポーネントに直面しています。 ILMは、約10種類の細胞外マトリックスタンパク質（ラミニン、アグリン、パールカン、ニドジェン、コラーゲン、いくつかのヘパリン硫酸プロテオグリカン）からなる基底膜である。開発中、その存在は、網膜組織発生、視神経軸索のナビゲーション、および神経節細胞1-3の生存のために不可欠である。しかし、ILMは、成体網膜において本質的でないし、外科的網膜損傷4を引き起こすことなく、特定の病状を除去することができる。遺伝子治療では、この膜は、硝子体内注射5のAAVを用いて網膜の効率的な伝達のための物理的障壁となる。 彼らのプロセスの豊富な樹枝状分岐を経て、ミュラー細胞は、栄養や規制スッポを提供網膜ニューロンおよび血管細胞の両方に室温。ミュラー細胞は、BRB 6の形成および維持において、網膜の恒常性の調節に関与する。網膜毛細血管内皮細胞、ミュラー細胞、星状細胞および周皮細胞間のタイトジャンクショ​​ンはBRBを形成する。 BRBは、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、呼吸器疾患などのretina.In多くの疾患に入るの特定の物質を防ぎ、網膜の低酸素症は、BRB 7-9を通る漏れの原因となる。この破裂は血管原性浮腫、網膜剥離や網膜損傷につながる血管透過性の増大と関連している。 ミュラー細胞は緊密BRBとILMの完全性の両方において重要な役割を果たし、血管および基底膜に関連している。その結果、ミュラーグリア細胞を標識すると、これらの網膜障壁の物理的状態の研究に特に関連する。 クラシック味方、BRB透過性は血漿アルブミンに非共有結合し、エバンスブルー色素の全身注射からなるエバンスブルーアッセイを用いて測定される。このアッセイは、網膜への血管10（プロトコルセクション5を参照）からのアルブミン漏出（中間サイズのタンパク質、〜66 kDaの）を測定する。また、血管漏出は、フルオレセインの漏れを証明する蛍光眼底血管造影により可視化することができる（小分子、〜359ダ、プロトコル第6節参照）11。それにもかかわらず、両方の方法は、小分子およびタンパク質へBRB透過性の評価を可能にするが、それらは、ILMの整合性についての情報を提供していません。 したがって、BRB透過性を研究するために、我々は、より大きな分子（ 例えば、AAV粒子、25 nmの直径）へBRB透過性に関する情報を提供するAAVベースのメソッドを使用していました。確かに、私たちの方法はそれを示唆している、血液中のAAV導入遺伝子の存在を検出することができる〜25nmの直径の粒子だろう血流に浸透させることができる。この方法はまた、病理学的状態におけるILM及び細胞外マトリックスタンパク質の構造に関する情報を提供する。 2つのAAV変異体は、そのような研究のために有用である：AAV5とShH10。網膜下に注入された、AAV5は、光受容体と網膜色素上皮12のための自然な指向性を持っていますが、完全なILM 5,13と、野生型網膜における硝子体内に投与した場合には、外側の網膜に渡って取得することはできません。 ShH10は、具体的には、ニューロン14,15の上にグ ​​リア細胞を標的とするように操作されているAAV変異体である。 ShH10は選択的に損なわれた障壁16と網膜の効率化と健康と病気の両方の網膜でミュラー細胞を標識する。 immuhistochemistry及び血液DNAの分析と結合され、これらのウイルスのツールは、網膜障壁の状態および疾患におけるそれらの関与（ 図1）に関する情報を提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:193px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">C57BL6J mice strain</td>
			<td style="width:107px;">JANVIER LABS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Ketamine 500</td>
			<td style="width:107px;">Virbac France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Xylazine Rompun 2%</td>
			<td style="width:107px;">Bayer Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Neosynephrine 5% Faure</td>
			<td style="width:107px;">Europhta</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>dilatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Mydriaticum 0,5%</td>
			<td style="width:107px;">Thea</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>dilatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Sterdex</td>
			<td style="width:107px;">Novartis</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>anti-inflammatory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Cryomatrix embedding resin</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">6769006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Superfrost Plus Adhesion Slides</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10143352</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">anti-laminin&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9393</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">anti-rhodopsin clone 4D2&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MABN15</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">anti-glutamine synthetase clone GS-6&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB302</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein</td>
			<td style="width:107px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">334</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">PNA Lectin&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L32459</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Alexa fluor conjugated secondary antibodies&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Fluorsave reagent</td>
			<td style="width:107px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">345789</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">QIAmp DNA Micro Kit&#160;</td>
			<td style="width:107px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">GoTaq DNA polymerase</td>
			<td style="width:107px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Evans Blue dye&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E2129&#160;</td>
			<td>dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">5 &#181;m filter&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Sodium Citrate&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Citric acid&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1909-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Formamide spectrophotometric&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">295876-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2456&#160;</td>
			<td>dye</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:225px;">Micron III</td>
			<td style="width:107px;">Phoenix Research Labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:193px;">Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Insulin Syringes</td>
			<td style="width:107px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS30M3109&#160;</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Syringe 10 &#181;l Hamilton</td>
			<td style="width:107px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">74487</td>
			<td>Seringue 1701</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Needle RN G33, 25 mm, PST 2&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11530332</td>
			<td>Intravitreal Injection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:225px;">UltraMicroPump UMP3</td>
			<td rowspan="2" style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">UMP3</td>
			<td style="width:193px;">Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller</td>
			<td style="width:119px;">UMP3-1</td>
			<td>Digital controller</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:225px;">Binocular magnifier SZ76</td>
			<td style="width:107px;">ADVILAB</td>
			<td style="width:119px;">ADV-76B2</td>
			<td style="width:193px;">Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Spring scissors straight - 8,5cm</td>
			<td rowspan="3" style="width:107px;">Bionic France S.a.r.l</td>
			<td style="width:119px;">15003-08</td>
			<td rowspan="3" style="width:193px;">Retinas dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Micro-ciseaux de Vannas courbe</td>
			<td style="width:119px;">15004-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Pince Dumont 5</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Veriti 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">4375786</td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Ultrasonic cleaner&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Laboratory Supplies</td>
			<td style="width:119px;">G1125P1T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Nanosep 30k omega tubes&#160;</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Speedvac</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SC 110 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Spectrofluorometer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">TECAN&#160;</td>
			<td style="width:119px;">infinite M1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using adeno-associated virus as a tool to study retinal barriers in disease

ミュラー細胞は網膜の主要なグリア細胞である。彼らのエンド足は外側と内側の制限膜（ILM）での網膜の限界を形成し、アストロサイト、周皮細胞および内皮細胞と一緒に彼らは血液網膜関門（BRB）を確立。 ILMは、組織学的に網膜と硝子体腔の境界を定義する基底膜として機能している間BRBは、血流と網膜の間で物質輸送を制限します。ミュラー細胞にラベルを付けると、これらの細胞はBRBとILMの不可欠な部分であるように、網膜障壁の物理的状態を研究するために特に関連しています。 BRBとILMの両方が頻繁に網膜疾患に変更され、病気の症状の原因であるされている。 そのようなエバンスブルーアッセイまたはフルオレセイン血管造影などのBRBの完全性を研究するためのいくつかのよく確立された方法があります。しかしこれらの方法は、BRB透過tの程度についての情報を提供しないナノメートル範囲の大きな分子、O。さらに、それらは、ILMのような他の網膜の障害の状態に関する情報を提供していません。網膜のILMと一緒BRB透過性を研究するために、我々は、疾患状態におけるILM及び細胞外マトリックスタンパク質の状態を示しているが、より大きな分子にBRBの透過性に関する情報を提供するAAVベースの方法を使用する。 2つのAAV変異体は、そのような研究のために有用である：AAV5とShH10。 AAV5は、光受容体のための自然な指向性を持っていますが、ILM（ すなわち、野生型の網膜に）完全である硝子体内に投与した場合には、外側の網膜に渡って取得することはできません。 ShH10は、グリア細胞に対して強い親和性を有しており、選択的に、健康と病気の両方の網膜にミュラーグリアにラベルを付けます。 ShH10はILMが侵害された網膜におけるより効率的な遺伝子送達を提供しています。免疫組織化学および血液DNA分析と相まってこれらのウイルスのツールは、疾患における網膜の障害の状態に光を当てる。

私たちは、動物モデルは、ILM（ - B図2A）の構造における変動を示している場合ShH10を使用してミュラーグリア細胞の網膜の伝達を増加期待しています。例えば、我々は野生型マウス16（ - F図2C）と比較して、このマウス系統におけるILMの透過性の増加を示す、硝子体内注射によって、そのDP71、ShH10標的の非存在下で特異的に、より効率的にミュラーグリア細胞...

Watch this Scientific Journal Video about Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease at JoVE.com

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

病における網膜障壁を研究するツールとしてアデノ随伴ウイルスを使用して、

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

using-adeno-associated-virus-as-tool-to-study-retinal-barriers

Research

JoVE Journal

Medicine

15.0K ビュー.  Sorbonne Universtés, UPMC Univ Paris 06, UMR_S 968. To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

ビデオ: Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

組換えアデノ随伴ウイルスの血清型3つのベクトルによる肝癌細胞の高効率形質導入

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

医学

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being analyzed 1, 2. This classical banding technique, however, is not reliable in identifying complex chromosomal aberrations such as those associated with cancer. To overcome the limitations of the banding technique, Spectral Karyotyping (SKY) is introduced to provide much reliable information on chromosome abnormalities.
SKY is a multicolor fluorescence in-situ hybridization (FISH) technique to detect metaphase chromosomes with spectral microscope 3, 4. SKY has been proven to be a valuable tool for the cytogenetic analysis of a broad range of chromosome abnormalities associated with a large number of genetic diseases and malignancies 5, 6. SKY involves the use of multicolor fluorescently-labelled DNA probes prepared from the degenerate oligonucleotide primers by PCR. Thus, every chromosome has a unique spectral color after in-situ hybridization with probes, which are differentially labelled with a mixture of fluorescent dyes (Rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC and Cy5.5). The probes used for SKY consist of up to 55 chromosome specific probes 7-10.
The procedure for SKY involves several steps (Figure 1). SKY requires the availability of cells with high mitotic index from normal or diseased tissue or blood. The chromosomes of a single cell from either a freshly isolated primary cell or a cell line are spread on a glass slide. This chromosome spread is labeled with a different combination of fluorescent dyes specific for each chromosome. For probe detection and image acquisition,the spectral imaging system consists of sagnac interferometer and a CCD camera. This allows measurement of the visible light spectrum emitted from the sample and to acquire a spectral image from individual chromosomes. HiSKY, the software used to analyze the results of the captured images, provides an easy identification of chromosome anomalies. The end result is a metaphase and a karyotype classification image, in which each pair of chromosomes has a distinct color (Figure 2). This allows easy identification of chromosome identities and translocations. For more details, please visit Applied Spectral Imaging website (<a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a>).
SKY was recently used for an identification of chromosome segregation defects and chromosome abnormalities in humans and mice with Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD), a genetic disease characterized by dysfunction in primary cilia 11-13. Using this technique, we demonstrated the presence of abnormal chromosome segregation and chromosomal defects in ADPKD patients and mouse models 14. Further analyses using SKY not only allowed us to identify chromosomal number and identity, but also to accurately detect very complex chromosomal aberrations such as chromosome deletions and translocations (Figure 2).

Spectral Karyotyping (SKY) is an advanced cytogenetics technique to identify genomic and chromosomal aberrations. This technique takes advantage of chromosome painting probes, which allow classification of all chromosomes. SKY can also identify complex chromosome aberrations and segregation defects in mice and humans with various diseases, including polycystic kidney disease.

多発性嚢胞腎疾患で、ヒトとマウスの染色体異常を研究するためにスペクトル核型分析

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Osteopathic Manipulative Treatment as a Useful Adjunctive Tool for Pneumonia

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in the hospitalization of 1.1 million patients2. With an average length of in-patient hospital stay of five days2, pneumonia and influenza comprise significant financial burden costing the United States $40.2 billion in 20053. Under the current Infectious Disease Society of America/American Thoracic Society guidelines, standard-of-care recommendations include the rapid administration of an appropriate antibiotic regiment, fluid replacement, and ventilation (if necessary). Non-standard therapies include the use of corticosteroids and statins; however, these therapies lack conclusive supporting evidence4. (Figure 1)

Osteopathic Manipulative Treatment (OMT) is a cost-effective adjunctive treatment of pneumonia that has been shown to reduce patients&#8217; length of hospital stay, duration of intravenous antibiotics, and incidence of respiratory failure or death when compared to subjects who received conventional care alone5. The use of manual manipulation techniques for pneumonia was first recorded as early as the Spanish influenza pandemic of 1918, when patients treated with standard medical care had an estimated mortality rate of 33%, compared to a 10% mortality rate in patients treated by osteopathic physicians6. When applied to the management of pneumonia, manual manipulation techniques bolster lymphatic flow, respiratory function, and immunological defense by targeting anatomical structures involved in the these systems7,8, 9, 10.

The objective of this review video-article is three-fold: a) summarize the findings of randomized controlled studies on the efficacy of OMT in adult patients with diagnosed pneumonia, b) demonstrate established protocols utilized by osteopathic physicians treating pneumonia, c) elucidate the physiological mechanisms behind manual manipulation of the respiratory and lymphatic systems. Specifically, we will discuss and demonstrate four routine techniques that address autonomics, lymph drainage, and rib cage mobility: 1) Rib Raising, 2) Thoracic Pump, 3) Doming of the Thoracic Diaphragm, and 4) Muscle Energy for Rib 1.5,11

Pneumonia is one of the top ten leading causes of death in the U.S. Osteopathic manipulative techniques (OMT) may be utilized as an adjunctive therapy in the treatment of pneumonia to enhance biomechanical and immune function; and ultimately, to reduce hospital stay, duration of antibiotics, incidence of respiratory failure, and mortality. In this video-article, we will review randomized controlled studies on the use of OMT in pneumonia patients, as well as demonstrate specific hands-on techniques that are routinely practiced by osteopathic physicians when treating pulmonary infections.

肺炎のための有用な補助的ツールとしてのオステオパシー整体

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an important role in maintaining cardiovascular health. The retina is a tissue that lines the interior of the eye and it is the only tissue that allows for a non-invasive analysis of the microvasculature. Nowadays, high-quality fundus images can be acquired using digital cameras. Retinal images can be collected in 5 min or less, even without dilatation of the pupils. This unobtrusive and fast procedure for visualizing the microcirculation is attractive to apply in epidemiological studies and to monitor cardiovascular health from early age up to old age.
Systemic diseases that affect the circulation can result in progressive morphological changes in the retinal vasculature. For example, changes in the vessel calibers of retinal arteries and veins have been associated with hypertension, atherosclerosis, and increased risk of stroke and myocardial infarction. The vessel widths are derived using image analysis software and the width of the six largest arteries and veins are summarized in the Central Retinal Arteriolar Equivalent (CRAE) and the Central Retinal Venular Equivalent (CRVE). The latter features have been shown useful to study the impact of modifiable lifestyle and environmental cardiovascular disease risk factors.
The procedures to acquire fundus images and the analysis steps to obtain CRAE and CRVE are described. Coefficients of variation of repeated measures of CRAE and CRVE are less than 2% and within-rater reliability is very high. Using a panel study, the rapid response of the retinal vessel calibers to short-term changes in particulate air pollution, a known risk factor for cardiovascular mortality and morbidity, is reported. In conclusion, retinal imaging is proposed as a convenient and instrumental tool for epidemiological studies to study microvascular responses to cardiovascular disease risk factors.

Retinal image analysis is an unobtrusive procedure for visualizing the microcirculation. The impact of cardiovascular disease risk factors can result in changes of retinal vessel calibers. The procedures to acquire fundus images and the steps for calculating the vessel calibers are described.

疫学研究では心血管疾患の危険因子への微小血管の応答を研究するための便利なツールとしての眼底写真

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Adapting Human Videofluoroscopic Swallow Study Methods to Detect and Characterize Dysphagia in Murine Disease Models

This study adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating translational dysphagia research. Successful outcomes are dependent upon three critical components: test chambers that permit self-feeding while standing unrestrained in a confined space, recipes that mask the aversive taste/odor of commercially-available oral contrast agents, and a step-by-step test protocol that permits quantification of swallow physiology. Elimination of one or more of these components will have a detrimental impact on the study results. Moreover, the energy level capability of the fluoroscopy system will determine which swallow parameters can be investigated. Most research centers have high energy fluoroscopes designed for use with people and larger animals, which results in exceptionally poor image quality when testing mice and other small rodents. Despite this limitation, we have identified seven VFSS parameters that are consistently quantifiable in mice when using a high energy fluoroscope in combination with the new murine VFSS protocol. We recently obtained a low energy fluoroscopy system with exceptionally high imaging resolution and magnification capabilities that was designed for use with mice and other small rodents. Preliminary work using this new system, in combination with the new murine VFSS protocol, has identified 13 swallow parameters that are consistently quantifiable in mice, which is nearly double the number obtained using conventional (i.e., high energy) fluoroscopes. Identification of additional swallow parameters is expected as we optimize the capabilities of this new system. Results thus far demonstrate the utility of using a low energy fluoroscopy system to detect and quantify subtle changes in swallow physiology that may otherwise be overlooked when using high energy fluoroscopes to investigate murine disease models.

This study successfully adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating translational dysphagia research.

マウス疾患モデルで嚥下障害を検出し、特徴づけるために、人間のVideofluoroscopicツバメ調査方法を適応させる

This study adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの定位注射を介して、パーキンソン病のα-シヌクレインベースのラットモデルの開発

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

ウサギにおける網膜下手術のためのステッププロトコルによってステップ

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

新生児マウス蝸牛移植法<em&gt;インビトロ</em&gt;聴覚研究のスクリーニングツール

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

眼底イメージングを使用して認知症を研究するには

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

心臓の遺伝子がマウスでの編集の CRISPR アデノ随伴ウイルスを介した配信

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...