相対湿度は、米国国立衛生研究所健康補助金 (R01HL116546 および R01 AR064241) によってサポートされます。

このプロトコルで使われる動物は、動物使用のガイドラインに従って、オハイオ州大学研究所動物資源で維持されました。すべての動物の研究は、制度的動物のケア、使用、およびオハイオ州立大学の審査委員会によって承認されました。
1. デザイン gRNAs CRISPR ベクターにクローニング
<ol><li>対象 20 ジストロフィン イントロンとイントロン (i20 と i23) 23 SaCas9 2 gRNAs を選択: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (PAM シーケンスは、下線、斜体)。 注: i20 と i23 のターゲット ・ サイトには、約 23 キロ塩基対 (kbp) 離れて。コーディングの遺伝子を破壊する 2 つの gRNAs NNGRRT PAM と共通のエクソンをターゲット シーケンス SaCas9 の (できれば NNGAAT、NNGGGT、NNGAGT) および 20 kbp の範囲内の距離をお勧めします。</li>
	<li>次の PCR パラメーターを使用して 1 アニーリング バッファー x gRNA oligos (100 µmol/L) をアニール (緩衝在庫をアニール x 5 には 0.5 mol/L 150 ミリ モル/L HEPES K 酢酸が含まれています-島、10 ミリ モル/L Mg 酢酸、pH7.4): 95 ° C 10 分の 0.4 の ° C と 95 に 59 ° C 90 サイクル減少あたりサイクルの 20 s、20 サイクルあたり 0.3 ° C 減少と 59 ~ 32 ° C の 90 サイクル s、20 サイクルあたり 0.3 ° C 減少 32 に 26 ° C の 20 サイクル s。</li>
	<li>PX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA に焼鈍 gRNA oligos を縛る反応の 1 つで BsaI と T4 DNA リガーゼを使って (1 μ L 50 ng/μ L pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA 焼鈍 1 μ L oligos、1.5 μ 10 x T4 DNA リガーゼ バッファー、0.5 μ L T4 DNA リガーゼ、1 μ 10 μ L ddH2O BsaI)、PCR サーマルサイクラーに次の反応条件を持つ: 5 サイクル [37 ° C 5 分および 16 ° C 10 分];37 ° C 20 分。80 ° C 5 分。</li>
	<li>100 μ g/ml、アンピシリン寒天培地で 24 h の 37 ° C で培養細胞をプレート、15 μ L 結紮製品を 30 μ L の有能なセルに変換します。</li>
	<li>5-10 コロニーと 37 ° C, 3 4 h のシェーカーのインキュベーターで 250 rpm で 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB 培地での培養を拾います。</li>
	<li>画面の PCR によるコロニー: PCR のマスターの組合せ、8 μ L ddH2O、1 μ L 大腸菌文化、1 μ L の 10 µmol/L U6 前方プライマー、1 μ L i20 または i23 gRNA 逆プライマー x 10 μ L 2。PCR の循環パラメーター: 95 ° C、95 ° C 30 秒、61 ° C 30 s、72 ° C 30 秒の 35 サイクル 5 分。</li>
	<li>追加 4 mL 新鮮な LB 培地 containing100 μ G/ml、アンピシリンと 37 ° C, 250 rpm で一晩文化肯定的なクローンの 5 mL 文化を準備します。</li>
	<li>適切なプラスミド抽出キットを使用して DNA のプラスミッドの浄化し、サンガーでプラスミドを確認 U6 前方プライマーによるシーケンスします。</li>
	<li>10 %fbs と 1 %dmem で C2C12 細胞の培養テスト遺伝子プラスミッドの効果を編集するための 〜 70% の confluency に到達するまでペン連鎖球菌。</li>
	<li>Electroporate 5 μ g 製造元のプロトコルに従って 1 × 106 C2C12 細胞に 1:1 のモル比で SaCas9/gRNA プラスミドの混合物の合計。</li>
	<li>48 時間後のトランスフェクション後 C2C12 細胞を収穫し、ゲノム DNA を抽出します。</li>
	<li>マウス ジストロフィン遺伝子座の PCR の反作用を実行するテンプレートとしての使用 100 ng ゲノム DNA: プライマー 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA を転送 (1 μ 10 µmol/L)、逆プライマー 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 μ 10 µmol/L) 10、緑の PCR x 2 μ L マスター ミックス 7 μ L ddH2O 1 μ L ゲノム DNA (100 ng)。PCR を使用してサイクリング条件 95 ° C、5 分として [95 ° C 30 s、61 ° C 30 s、72 ° C 30 s] 35 サイクル 72 ° C 2 分。</li>
</ol>2. 下さい rAAV 生産
<ol><li>細胞を培養する 20 に 40 15 cm 皿の上に AD293 細胞を播くし、10 %fbs と 1 %dmem で維持ペン-連鎖球菌の transfection のための ~ 90% の confluency に到達するまで。</li>
	<li>200 μ L で希釈 3 プラスミド減少 (一皿) 血清中: 1) 10 μ g の pHelper;2) 5 μ g pXR (rh.74 または他の血清型)、3) pX601 i20 と pX601 i23 混合物 (1:1) の 5 μ g の合計。80 μ L PEI と混合してポリエチレンイミン (PEI) トランスフェクションを行い、滴状に 10 分追加 AD293 細胞培養に混合物を室温で孵化させなさい。</li>
	<li>AAV ウイルス産生、72 h ポスト トランスフェクション後 10 分 1100 × g で遠心分離してメディアと AD293 細胞ペレットの両方を収集するのに細胞スクレーパーを使用します。</li>
	<li>液体窒素と 42 ° C の水浴でインキュベーションを交互に 3 凍結融解サイクルに続いて 15 mL 下さい rAAV 換散バッファー (50 ミリ モル/L 150 ミリ モル/L 塩化ナトリウム、pH 8.5、トリス基地) 内細胞ペレットを再懸濁します。-80 ° C、彼らがすぐに処理されていない場合は将来、処理セル lysates を格納します。</li>
	<li>0.45 μ m フィルターでフィルター文化メディアと 8% の最終的な集中に 2.5 mol/l 塩化ナトリウム 40 %peg8000 を追加します。4 ° C 1 時間の混合物と 1100 × g で 15 分間遠心を孵化させなさい。</li>
	<li>下さい rAAV 換散バッファーでペレットを再懸濁します、ステップ 2.3, 1 h 37 ° C で benzonase (50 U/mL) 治療が続きますからのセル lysates と結合します。</li>
	<li>4 ° C で 15 分間混合物 1100 x g を含有する benzonase 処理下さい rAAV を遠心し、上清 (原油下さい rAAV 準備)。</li>
</ol>3. 下さい rAAV 浄化と濃度
<ol><li>上から下に次の順序で遠心管の iodixanol 勾配に原油下さい rAAV 準備をロード: 原油 AAV ライセート (〜 15 mL) 8 mL の 15 パーセント 6 mL 25% Iodixanol Iodixanol、5 mL 40 %5 mL 58% Iodixanol Iodixanol。1 x DPBS を使用してトップ チューブの残りの空のボリュームを埋めます。</li>
	<li>遠心分離機のサンプル 10 ° C で 120 分の超遠心機ローターで 230,000 x g で 18 G 針で下さい rAAV 粒子を含む 40% 勾配率の 3-4 mL を収集しています。</li>
	<li>1 x DPBS と遠心遠心フィルター ユニット (MWCO 100 kDa) を使用して下さい rAAV 粒子を希釈します。に対してこの手順を繰り返します 3-5 回、最終的に 300-500 μ L に下さい rAAV 準備を集中。</li>
</ol>4. 下さい rAAV あります。
<ol><li>2 μ L 集中して下さい rAAV、エタノール、3 M NaOAc と 20 μ L ddH2o. で再懸濁します沈殿物からゲノム DNA を抽出します。</li>
	<li>PX601 プラスミドのシリアル希釈して下さい rAAV 定量用標準曲線を取得: 1 × 109, 1 x 108,1 x 10 の71 x 106、各 10 μ L ddH2O. Dilute DNAase 処理下さい rAAV で 1 x 10 の5枚サンプルとして 1:10、1:50、1: 100、1: 1000。</li>
	<li>リアルタイム PCR システムの製造元の指示に従って qPCR キットを使用して量的なリアルタイム PCR (qPCR) して下さい rAAV 価を決定する: 1 μ 10 各プライマーの µmol/L (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC、5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC)、5 PCR マスター ミックス、希釈 1 μ L x 2 μ L下さい rAAV サンプルと 2 μ L ddH2修次サイクリング パラメーター反応を実行: 95 ° C [95 ° C 5 秒、61 ° C 20 秒] 45 サイクル 3 分。</li>
</ol>5. 静脈と新生児mdx/研究+/-マウスに rAAVrh.74 CRISPR の腹腔内投与
<ol><li>1 分間氷の上を置くことによって、 mdx/研究+/-マウスの子犬 (3 日目) を固定し、1 x 1012 50 μ L/マウス レトロ軌道アプローチまたは腹腔内注射で全身でウイルス粒子とを管理します。</li>
	<li>回復し、彼らのホームのケージに戻しマウスを許可します。下さい rAAV 投与後 10 週間で組織の採取の CO2の露出によってマウスを安楽死させます。</li>
	<li>ゲノム DNA および RNA の抽出、イソペンタン セクショニング化合物最適切削温度と組織を凍結する液体窒素を冷却の使用のためのティッシュのスナップ-凍結。</li>
</ol>6. 成果を編集ターゲット遺伝子の解析
<ol><li>
ゲノム DNA の PCR 解析
	<ol>
<li>Mdx/研究+/-マウスの心臓組織からのゲノム DNA 治療下さい rAAV 有無合計を分離します。</li>
		<li>Pcr のステップ 1.12 で同じプロトコルを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ジストロフィンの発現の RT-PCR 解析
	<ol>
<li>製造元のマニュアルに従って RNA 抽出キットの心臓組織からの総 RNA を抽出します。</li>
		<li>逆のトランスクリプションを実行、RNase フリーの DNase の総 RNA の事前治療し、最初繊維の cDNA を合成する逆転写キットのテンプレートとして扱われた RNA の 5 μ g を使用します。</li>
		<li>ジストロフィン cDNA プライマーのジストロフィン式の RT-PCR 解析で逆のトランスクリプション製品を使用: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT、5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
QPCR による効果を編集遺伝子を推定します。
	<ol>
<li>編集 (エクソン 21) の前方のプライマーを用いたエクソン 22 含む転写産物の減少を検出する RT-PCR によって有効性遺伝子を推定: 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA、および逆プライマー (エクソン 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT。前方のプライマーと参照の遺伝子としての Gapdh の使用: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC と逆プライマー: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT。</li>
		<li>リアルタイム PCR システムと 2 段階反応条件の製造元の指示に従って qPCR キットを使用して量的なリアルタイム PCR (qPCR) を実行: 95 ° C 3 分、95 ° C 5 秒、61 ° C 30 秒 45 サイクル。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ジストロフィンの発現を分析する染色蛍光抗体法
	<ol>
<li>修正プログラムは、10 μ m の厚さでクライオスタットを用いた凍結組織で 15 分間室温で 4% パラホルムアルデヒド凍結切片をカットします。</li>
		<li>PBS で 2 倍を洗って、1 h のソリューション (10% 馬血清) をブロックで孵化させなさい。</li>
		<li>4 ° c 夜間、抗ジストロフィンの一次抗体を孵化させなさい。</li>
		<li>PBS でスライドを洗って 3 x 5 分と蛍光二次抗体 (1: 500) 1 時間室温で孵化させなさい。</li>
		<li>DAPI でメディアをマウントを使用し、倒立の共焦点顕微鏡とイメージングのスライドをマウントします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7 T7E1 法によるオフのターゲット分析
<ol><li>オンライン CRISPR を使用して潜在的なターゲットをサイト デザイン ツールなどを予測する < http://crispr.mit.edu>。</li>
	<li>PCR によって 5-10 潜在的なターゲットをサイト上部を覆っているゲノムの領域を増幅する: ゲノム DNA 200 ng、1 μ L 高忠実度 DNA ポリメラーゼ、5 μ L の 10 倍 PCR バッファーのミックス、1.5 μ 10 50 μ L に容量を調整すること、サイト固有の前方および逆引きのプライマーの µmol/LddH2o.</li>
	<li>電気泳動で PCR の製品を実行、抽出し、ゲル抽出キットを使用して DNA を浄化します。分光光度計を使用して濃度を測定します。</li>
	<li>変化と再アニーリング PCR サーマルサイクラーを使用してバッファー 2.1 でゆっくりと精製 amplicons ヘテロ二本鎖形成を促進します。ステップ 1.2 の詳細として同じサイクリング条件を使用します。</li>
	<li>0.5 μ L T7E1 酵素、37 ° C で 30 分間再熱処理製品を消化し、1 2% アガロースゲルを用いた電気泳動による反応を分析します。 注: ターゲットのディープ シーケンスによって、amplicons 分析もできます。</li>
</ol>

<ol>
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R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Sarcoglycan+gene+transfer+decreases+fibrosis+and+restores+force+in+LGMD2E+mice.">beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice.</a> Gene therapy. 23, 57-66 (2016).</li><li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmapheresis+eliminates+the+negative+impact+of+AAV+antibodies+on+microdystrophin+gene+expression+following+vascular+delivery.">Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery.</a> Mol Ther. 22, 338-347 (2014).</li><li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+delivery+of+rAAVrh74.MCK.GALGT2+to+the+gastrocnemius+muscle+of+the+rhesus+macaque+stimulates+the+expression+of+dystrophin+and+laminin+alpha2+surrogates.">Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates.</a> Mol Ther. 22, 713-724 (2014).</li><li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases.">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5, 407-415 (2015).</li><li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases.">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).</li></ol>

利害の対立は存在しません。

このプロトコルでは、生体内で心臓遺伝子 SaCas9 と 2 つの gRNAs の rAAVrh.74 を介した配信を使用して産後のマウスで編集を達成するために必要なすべての手順を詳しく説明します。前述のとおり、このアプローチは、私たちの仕事の27日に記載されている筋ジストロフィー マウスにおけるジストロフィン式を復元する使用ことができますがそれはの長いプロセスを使用?...

クラスター化、定期的に空間、短い回文リピート (CRISPR) 技術はゲノム工学の最も最近の進歩を表し、細胞および生物における遺伝学の現在の習慣をもたらしました。CRISPR 関連のエンドヌクレアーゼ CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9) などを直接単一ガイド RNA (gRNA) を利用してゲノムの CRISPR ベース編集とは、protospacer に補足シーケンスのゲノム DNA ターゲットに Cpf1 と gRNA でエンコードされた、特定の protospacer の隣接するモチーフ (PAM) の1,2。PAM は、Cas9 または Cpf1 の遺伝子の細菌種によって異なります。化膿連鎖球菌(SpCas9) から派生した一般的に使用される Cas9 ヌクレアーゼは、非ターゲット鎖に DNA に直接下流ターゲット シーケンスのある NGG の PAM のシーケンスを認識します。ターゲット ・ サイトで Cas9 と Cpf1 蛋白質を生成する非相同末端結合 (NHEJ) と相同性向け修理 (HDR) 経路3を含む組み込みの細胞 DNA 修復機構によって修復され、二重鎖切断 (DSB) 4。相同組換えの DNA のテンプレートがない場合は、DSB は主に修復に挿入や削除 (オクターリピート) 生じるエラーを起こしやすい NHEJ 経路による DSB がコーディングで作成された場合、フレーム シフト突然変異を引き起こしているヌクレオチドの遺伝子5,6の領域。したがって、遺伝子の機能を調べるために、CRISPR システムを様々 な細胞モデルと全有機体の機能喪失変異をエンジニアに広く使用がされています。また、触媒非アクティブの Cas9 と Cpf1 発現に開発されている、epigenetically ターゲット遺伝子7,8の発現を調節します。
最近では、SpCas9 と SaCas9 (黄色ブドウ球菌由来) パッケージ化されている遺伝子組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV) ベクトルの人間の病気の動物モデルの生後遺伝子補正のために特に、デュシェンヌ型筋ジストロフィー筋ジストロフィー (DMD)9,10、11,12,13,14,15。DMD はジストロフィン蛋白質16,17をエンコード、 DMDの遺伝子で突然変異によって引き起こされる致命的な X 連鎖劣性病気新生児マスス クリーニング18によると約 1 つで 3500 男性出産に影響を与える,19. 進歩的な筋肉弱さと無駄が特徴です。DMD 患者は通常 20-30 年20歳で 10 歳以上 12 歳未満と呼吸や心臓の障害で死ぬと歩行能力を失います。心筋症を開発する特に、> 90% の DMD 患者と DMD 患者21,22の死の主要な原因を表します。Deflazacort (抗炎症薬) と Eteplirsen (エクソン 51 をスキップのための薬をスキップ エクソン) 最近によって承認されている DMD の食品医薬品局 (FDA)23,24、これらの治療のどれもがゲノム DNA レベルで遺伝的欠陥を修正します。エクソン 23 ジストロフィン遺伝子の点突然変異を運ぶ、mdx マウスは、DMD モデル25として広く使用されています。さらに、我々 は以前、機能的なジストロフィン式カバー エクソン 21、22、23 筋肉内の広告-SpCas9/gRNA 配信9 を使用してmdxマウス骨格筋でゲノム DNA のフレームの削除によって復元された実証、および静脈内、腹腔内の rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 配信26を使用してmdx/研究+/-マウスの心臓の筋肉。
このプロトコルで生後心臓遺伝子の心臓の筋肉のセクションでジストロフィン解析 gRNA 設計からの rAAVrh.74-SaCas9/gRNA ベクトルを使用してmdx/研究+/-マウスでジストロフィンを復元する編集のあらゆるステップ詳細に述べる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Safety Cabinets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1347</td>
			<td>1300 Series A2 Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI</td>
			<td>New England BioLabs Inc</td>
			<td>RO535S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 150mm</td>
			<td>Nest Scientific USA</td>
			<td>715001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Leica CM3050S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT10017CV</td>
			<td>Corning cellgro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystrophin antibody</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>E2660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-Ion Midi Plasmdi Kits</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26-140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Unit, 0.45&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Master Mixes</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed plasmid mini kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab139501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 2239 Water Bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-460-11Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Heat Block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, LLC</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015243001</td>
			<td>LightCycler 480 Instrument II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Capacity Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-910</td>
			<td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002445</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>NanoDrop&#8482; 2000/2000c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for i20-F</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for i20-R</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for i23-F</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for i23-R</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510-1kg-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Seal centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter Inc</td>
			<td>342414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>QS2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Inc</td>
			<td>337922</td>
			<td>Type 70Ti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs Inc</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter Inc</td>
			<td>8043-30-1192</td>
			<td>Optima le-80k</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC510096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adeno-associated virus-mediated delivery of crispr for cardiac gene editing in mice

クラスター化、定期的に空間、短い、回文の繰り返し (CRISPR) システムは、培養細胞のさまざまな種から生きている有機体のゲノム工学を促進しています。CRISPR 技術は、人間の病気の治療薬として検討されています。概念実証データは可能性とマウスモデルを用いたデュシェンヌ型筋ジストロフィー (DMD) の遺伝子編集ベース アプローチの有効性を示す最近の研究に代表される非常に心強いものです。黄色ブドウ球菌CRISPR 関連タンパク質 9 の効率的な心筋配信 (SaCas9) と 2 つの特に、組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV) 血清型 rh.74 (rAAVrh.74) の静脈内投与と腹腔内注入が有効になって23 マウスDmd遺伝子のエクソンに変異のコドン ゲノム領域を削除する Rna (gRNA) をご案内します。興味の遺伝子をノックアウトして生後マウスの心機能を研究、gRNA の遺伝子のコーディングの地域をターゲットに設計されている場合、これと同じアプローチを使用もできます。このプロトコルでは rAAVrh.74 CRISPR ベクトルをエンジニア リングする方法と新生児マウスで高効率な心臓配送を達成するために詳細に示します。

体内研究下さい rAAV に包む前に培養細胞の標的ゲノム DNA 領域の削除を誘導する gRNAs の有効性を評価しなければなりません。このため、gRNAs と SaCas9 を表現する構造であった C2C12 細胞に electroporated とターゲット サイト (図 1) を側面プライマーと PCR によるゲノム DNA を調べた。PCR の製品の ~ 500 bp ターゲット DNA 遺伝子制御の細胞ゲノム DNA のサ?...

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Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

ここで生体内で心臓遺伝子組換えアデノ ウイルス (下さい rAAV) を用いたマウスで編集を実行する詳細なプロトコルを提供-CRISPR の配信を介する。このプロトコルは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの筋ジストロフィーの心筋症を治療するために有望な治療戦略を提供しています、生後マウス心臓固有ノックアウトを生成する使用ことができます。

心臓の遺伝子がマウスでの編集の CRISPR アデノ随伴ウイルスを介した配信

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

adeno-associated-virus-mediated-delivery-crispr-for-cardiac-gene

Research

JoVE Journal

Medicine

8.1K ビュー.  Ohio State University Wexner Medical Center. ここで生体内で心臓遺伝子組換えアデノ ウイルス (下さい rAAV) を用いたマウスで編集を実行する詳細なプロトコルを提供-CRISPR の配信を介する。このプロトコルは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの筋ジストロフィーの心筋症を治療するために有望な治療戦略を提供しています、生後マウス心臓固有ノックアウトを生成する使用ことができます?...

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High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

組換えアデノ随伴ウイルスの血清型3つのベクトルによる肝癌細胞の高効率形質導入

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

医学

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

免疫不全マウスにおけるヒト網膜芽細胞腫の腫瘍の確立と伝播

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the arteries (&beta;2). When systemically administered, it increases cardiac demand. Thus, dobutamine unmasks abnormal rhythm or ischemic areas potentially at risk of infarction. 
Monitoring of heart function during a cardiac stress test can be performed by either ecocardiography or cardiac catheterization. The latter is an invasive but more accurate and informative technique that the former.
Cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization accomplished as described here allows, in a single experiment, the measurement of the following hemodynamic parameters: heart rate (HR), systolic pressure, diastolic pressure, end-diastolic pressure, maximal positive pressure development (dP/dtmax) and maximal negative pressure development (dP/dtmin), at baseline conditions and under increasing doses of dobutamine.
As expected, in normal mice we observed a dobutamine dose-related increase in HR, dP/dtmax and dP/dtmin. Moreover, at the highest dose tested (12 ng/g/min) the cardiac decompensation of high fat diet-induced obese mice was unmasked.

We describe the protocol to perform a cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization in normal mice. Also we show its application to unmask subclinical cardiac disease in high fat diet-induced obese mice.

心臓ストレステストドブタミンによって誘導され、マウスにおける心臓カテーテル検査によって監視される

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

遺伝子送達研究のための同所膀胱癌モデル

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well as to excrete bilirubin and other metabolic products. In the liver, the experimental obstruction of the extrahepatic biliary system initiates a complex cascade of pathological events that leads to cholestasis and inflammation resulting in a strong fibrotic reaction originating from the periportal fields. Therefore, surgical ligation of the common bile duct has become the most commonly used model to induce obstructive cholestatic injury in rodents and to study the molecular and cellular events that underlie these pathophysiological mechanisms induced by inappropriate bile flow. In recent years, different surgical techniques have been described that either allow reconnection or reanastomosis after bile duct ligation (BDL), e.g., partial BDL, or other microsurgical methods for specific research questions. However, the most frequently used model is the complete obstruction of the common bile duct that induces a strong fibrotic response after 21 to 28 days. The mortality rate can be high due to infectious complications or technical inaccuracies. Here we provide a detailed surgical procedure for the BDL model in mice that induce a highly reproducible fibrotic response in accordance to the 3R rule for animal welfare postulated by Russel and Burch in 1959.

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

マウスにおける胆管結紮：閉塞性胆汁うっ滞による炎症性肝障害と線維症の誘発

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

病における網膜障壁を研究するツールとしてアデノ随伴ウイルスを使用して、

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの定位注射を介して、パーキンソン病のα-シヌクレインベースのラットモデルの開発

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

新生児マウスの心筋梗塞、心臓再生のモデル

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of inner ear gene therapy is to find a delivery method which results in consistent transduction efficiency of targeted cell types while minimizing hearing loss. In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a viable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear. The easy anatomic identification of the posterior semicircular canal, as well as minimal manipulation of the temporal bone required, make this surgical approach an attractive option for inner ear gene delivery.

In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a reliable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear.

新生児マウス内耳遺伝子デリバリーの後半規管アプローチ

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.