術中手術モニター解析は、がん組織の複雑な切除を正確かつ迅速に確認するための診断ツールを必要とするため、腫瘍切除手術において依然として大きな課題です。その後、陽性の外科的マージンのために繰り返し手術を避けることが可能です。当社の高速オープントップ紫外線光音響顕微鏡は、5×5ミリメートル四方のイメージング領域で組織サンプルの標識組織学的画像を18分以内に提供することができ、術中の外科的マージン分析に大きな可能性を示しています。
手順を実演するのは、私の研究室の博士課程最終学年のXiufeng Liです。励起源として波長266ナノメートルのQスイッチダイオード励起固体レーザーを使用して、顕微鏡システムの光学照明を設定することから始めます。2つの凸レンズを設置してレーザー光を展開し、空間フィルタリングのために最初の凸レンズの焦点の近くにピンホールを配置します。
1Dガルバノミラーを使用して、レーザービームを上方に反射します。対物レンズの助けを借りて、レーザービームをサンプルに焦点を合わせます。アクティブエリアが上を向いたリング状の集束UTを、下部に光学的に透明な窓が薄い石英カバースリップで覆われたラボ製の水槽に固定し、水槽を顕微鏡の2軸手動ステージに取り付けてUTの横方向の位置を制御します。完了したら、UVレーザーをオンにし、UTの位置を調整してレーザービームがUTの中心を通過できるようにしてから、UVレーザーをオフにして水タンクを脱イオン水で満たし、UTを完全に浸します。UTの出力を2つのアンプに接続して合計ゲインを56デシベルにしてから、2番目のアンプの出力をコンピュータに取り付けられたデータ集録カード(DAQ)に接続します。
次に、xy電動ステージに接続されたz軸手動ステージにサンプルホルダーを取り付け、サンプルホルダーの空き穴を囲む4枚の両面テープを配置します。その後、黒いテープをスライドガラスに貼り付け、スライドガラスをサンプルホルダーの穴を覆うように黒いテープを下に向けて配置して、システムの位置を合わせます。スライドガラスをサンプルホルダーに押し付けた後、サンプルホルダーを下げてスライドガラスを水に浸します。
リング状のUTとアンプを取り外し、UTをパルサー/レシーバーに接続し、パルサー/レシーバーの出力をオシロスコープに接続します。パルサー/レシーバーをパルスエコーモードに動作させ、パルス振幅を6、ゲインを20デシベルにします。パラメータが設定されたら、サンプルホルダのz位置を調整し、超音波信号が最大となる音響焦点面の位置を定義します。
ゲインを60デシベルに設定する前にパルス/レシーバーを伝送モードに変更し、レーザー出力を有効にして対物レンズのz位置を調整して、オシロスコープで測定される光音響またはPA信号を最大化します。生成されたPA信号を対称かつ最大にするには、リング状のUTの横方向の位置を調整してから、サンプルホルダのz位置を調整してPA信号を最大化します。対物レンズとサンプルホルダーのz位置の調整を繰り返して、PA信号の対称性と振幅を最適化します。
PA信号が最適化されたら、PA波がUTに到達するのにかかった時間遅延または時間をオシロスコープに記録します。サンプルホルダーを動かして、黒いテープのさまざまな位置を画像化します。ブラックテープの各位置から生成されるPA信号が、以前に測定されたものと同じ時間遅延を持つように、サンプルホルダの平坦度を調整します。
システムの位置合わせが完了したら、レーザーをオフにし、UTを2つのアンプに接続します。ホルマリン固定およびパラフィン包埋マウス脳スライスを作製し、採取した脳を10%中性緩衝ホルマリンで固定した。24時間後、段階的なアルコールで脱水し、キシレンでクリアし、パラフィンで埋め込むことによって固定脳を処理します。
ミクロトームを使用して、埋め込まれた脳の厚さ5マイクロメートルのスライスを得る。サンプルスライスを石英スライドの上に置き、摂氏60度のオーブンで1時間乾燥させます。その後、パラフィンの高いバックグラウンドシグナルを避けるために、クリアリング剤で脳切片を脱パラフィン化する。
新鮮なマウス脳スライスを調製するには、採取したマウス脳をPBSで洗浄し、次いで脳サンプルの厚さ5ミリメートルのスライスを手で切断し、続いて脳スライスをPBSで洗浄して断面上の血液を除去した。試料の配置には、厚さ10マイクロメートルのUV透過ポリエチレン膜を備えたラボ製の試料槽を用意し、膜に水滴を加えて試料槽上に生体試料を載せて水を覆う。次に、試料収容タンクを試料ホルダ上に置き、試料ホルダの空孔を覆うようにする。
UVレーザーを外部トリガーモードに設定し、ラボで構築されたラボビュープログラムを使用して、原稿に記載されているようにスキャンパラメータを設定します。x軸モーターとy軸モーターの移動ステップ数を設定して小さな領域でトライアルスキャンを開始し、z軸手動ステージを調整してサンプルを焦点面に配置し、最大のPA信号を取得します。x軸モーターとy軸モーターの両方を所望の開始点まで移動させ、xn値とyn値を設定して走査領域を設定した後、画像取得プログラムを起動します。
画像が必要な場合は、レーザーをオフにしてサンプルホルダーを取り外します。新鮮な生物学的組織を10%中性緩衝ホルマリンに保存する。収集されたPA信号を使用して、ラボで構築された画像処理アルゴリズムの助けを借りて、最大振幅投影画像を再構築します。
代表的な分析は、FFPEマウス脳スライスのUV-PAMおよびH&E画像を示す。ズームインしたUV-PAM画像では、個々の細胞核が解像できた。対応する細胞核は、標準的なH&E染色画像で見出され、細胞イメージングのための現在のシステムの高精度を示した。
ディープラーニングアルゴリズムを適用して、グレースケールのUV-PAM画像を仮想H&E染色画像に転送しました。リング状の超音波探触子の位置を調整して、システムの位置合わせ中にUV光が中心を通過できるようにすることが重要です。これにより、検出可能な光音響信号が得られ、レーザーがオンのときにさらに最適化されます。
当社の分類アルゴリズムは、画像内の腫瘍および正常領域を分類するためにさらに組み込むことができ、医療専門家のための補助画像および診断プラットフォームとして機能する。
