L'analisi del monitor chirurgico intraoperatorio è ancora una grande sfida negli interventi chirurgici di resezione del tumore perché richiede uno strumento diagnostico per confermare la complessa escissione del tessuto canceroso in modo accurato e rapido. È quindi possibile evitare ripetuti interventi chirurgici a causa di un margine chirurgico positivo. La nostra microscopia fotoacustica ultravioletta open-top ad alta velocità è in grado di fornire immagini istologiche marcate di campioni di tessuto entro 18 minuti con un'area di imaging di cinque per cinque millimetri quadrati, mostrando un grande potenziale per l'analisi del margine chirurgico intraoperatorio.
A dimostrare la procedura sarà Xiufeng Li, uno studente di dottorato dell'ultimo anno del mio laboratorio. Inizia con l'impostazione dell'illuminazione ottica per il sistema microscopico utilizzando un laser a stato solido pompato a diodi Q-switch con una lunghezza d'onda di 266 nanometri come sorgente di eccitazione. Installare due lenti convesse per espandere il raggio laser e posizionare un foro stenopeico vicino al punto focale della prima lente convessa per il filtraggio spaziale.
Utilizzare uno specchio galvanometrico 1D per riflettere il raggio laser verso l'alto. Con l'aiuto della lente dell'obiettivo, focalizzare il raggio laser su un campione. Fissare l'UT focalizzato a forma di anello con l'area attiva rivolta verso l'alto in un serbatoio d'acqua realizzato in laboratorio con una finestra otticamente trasparente nella parte inferiore coperta da un sottile coperchio di quarzo, quindi collegare il serbatoio dell'acqua a uno stadio manuale a due assi del microscopio per controllare la posizione laterale dell'UT. Al termine, accendere il laser UV e regolare la posizione dell'UT per consentire al raggio laser di passare attraverso il centro dell'UT, quindi spegnere il laser UV e riempire il serbatoio dell'acqua con acqua deionizzata per immergere completamente l'UT. Collegare l'uscita dell'UT a due amplificatori per ottenere un guadagno totale di 56 decibel e quindi collegare l'uscita del secondo amplificatore a una scheda di acquisizione dati, o DAQ, installata nel computer.
Quindi, collegare un portacampioni a uno stadio manuale dell'asse z collegato a stadi motorizzati xy, seguito dal posizionamento di quattro pezzi di nastro biadesivo che circondano il foro vuoto del portacampioni. Successivamente, procedere all'allineamento del sistema attaccando del nastro nero a una diapositiva di vetro e quindi posizionando la diapositiva di vetro per coprire il foro del portacampioni con il nastro nero rivolto verso il basso. Dopo aver premuto il vetrino sul portacampioni, abbassare il portacampioni per immergere il vetrino nell'acqua.
Scollegare l'UT a forma di anello e gli amplificatori, quindi collegare l'UT al pulsatore/ricevitore e l'uscita del pulsatore/ricevitore a un oscilloscopio. Azionare l'pulsatore/ricevitore in modalità eco di impulso con l'ampiezza dell'impulso di sei e il guadagno a 20 decibel. Una volta impostati i parametri, regolare la posizione z del portacampioni, definire la posizione del piano focale acustico dove i segnali ultrasonici sono massimi.
Cambiare l'impulso/ricevitore in modalità di trasmissione prima di impostare il guadagno a 60 decibel, quindi abilitare l'uscita laser e regolare la posizione z dell'obiettivo per massimizzare i segnali fotoacustici o PA misurati dall'oscilloscopio. Per rendere il segnale PA generato simmetrico e massimo, regolare la posizione laterale dell'UT a forma di anello, quindi regolare la posizione z del portacampioni per massimizzare i segnali PA. Ripetere le regolazioni per la posizione z della lente dell'obiettivo e del portacampioni per ottimizzare la simmetria e l'ampiezza dei segnali PA.
Quando i segnali PA sono ottimizzati, registrare il ritardo temporale o il tempo impiegato dalle onde PA per raggiungere l'UT sull'oscilloscopio. Spostare il supporto del campione in diverse posizioni del nastro nero. Regolare la planarità dei portacampioni in modo che i segnali PA generati da ciascuna posizione del nastro nero abbiano lo stesso ritardo temporale di quello misurato in precedenza.
Al termine dell'allineamento del sistema, spegnere il laser e collegare l'UT ai due amplificatori. Per preparare una fetta di cervello di topo fissata alla formalina e incorporata nella paraffina, ha fissato il cervello raccolto in formalina tamponata neutra al 10%. Dopo 24 ore, elaborare il cervello fisso per disidratazione con alcol graduato, pulizia con xilene e incorporamento con paraffina.
Usa un microtomo per ottenere fette spesse cinque micrometri del cervello incorporato. Posizionare le fette campione sui vetrini di quarzo per asciugare in forno a 60 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, de-paraffinizzare le sezioni cerebrali con un agente di compensazione per evitare alti segnali di fondo di paraffina.
Per preparare una nuova fetta di cervello di topo, lavare il cervello di topo raccolto con PBS e quindi tagliare una fetta di cinque millimetri di spessore del campione di cervello a mano seguita dal lavaggio della fetta di cervello con PBS per rimuovere il sangue sulla sezione trasversale. Per il posizionamento del campione, preparare un serbatoio di campioni realizzato in laboratorio con una membrana in polietilene trasparente UV con uno spessore di 10 micrometri, quindi aggiungere una goccia d'acqua alla membrana e posizionare il campione biologico sul serbatoio del campione per coprire l'acqua. Quindi, posizionare il serbatoio contenente il campione sul portacampioni assicurandosi di coprire il foro vuoto del portacampioni.
Impostare il laser UV sulla modalità trigger esterno e utilizzare il programma lab view creato in laboratorio per impostare i parametri di scansione come descritto nel manoscritto. Avviare la scansione di prova su una piccola regione impostando il numero di passi mobili dei motori degli assi x e y, quindi regolare lo stadio manuale dell'asse z per posizionare il campione sul piano focale per ottenere il massimo dei segnali PA. Dopo aver spostato i motori dell'asse x e y nel punto di partenza desiderato e aver impostato la regione di scansione impostando i valori xn e yn, avviare il programma di acquisizione delle immagini.
Quando le immagini sono necessarie, spegnere il laser e rimuovere il supporto del campione. Conservare i tessuti biologici freschi in formalina tamponata neutra al 10%. Utilizza i segnali PA raccolti per ricostruire l'immagine di proiezione di ampiezza massima con l'aiuto di un algoritmo di elaborazione delle immagini costruito in laboratorio.
L'analisi rappresentativa mostra le immagini UV-PAM e H&E di una fetta di cervello di topo FFPE. Nell'immagine UV-PAM ingrandita, i singoli nuclei cellulari potrebbero essere risolti. I nuclei cellulari corrispondenti sono stati trovati nelle immagini standard colorate di H & E, mostrando l'elevata precisione dell'attuale sistema per l'imaging cellulare.
È stato applicato un algoritmo di deep learning per trasferire l'immagine UV-PAM in scala di grigi in un'immagine virtuale macchiata di H & E. È importante regolare la posizione del trasduttore ad ultrasuoni a forma di anello per consentire alla luce UV di passare attraverso un centro durante l'allineamento del sistema. Ciò garantisce che sia possibile ottenere un segnale fotoacustico rilevabile e ottimizzarlo ulteriormente quando il laser è acceso.
Il nostro algoritmo di classificazione può essere ulteriormente incorporato per classificare il tumore e le regioni normali nelle immagini, fungendo da imaging assistivo e piattaforma diagnostica per i professionisti medici.
