A análise do monitor cirúrgico intraoperatório ainda é um grande desafio nas cirurgias de ressecção do tumor, pois requer uma ferramenta de diagnóstico para confirmar a excisão complexa do tecido cancerígeno com precisão e rapidez. É possível evitar cirurgias repetidas devido a uma margem cirúrgica positiva. Nossa microscopia fotoacústica ultravioleta de alta velocidade pode fornecer imagens histológicas rotuladas de amostras de tecido dentro de 18 minutos com uma área de imagem de cinco por cinco milímetros quadrados, mostrando grande potencial para análise de margem cirúrgica intraoperatória.
Demonstrando o procedimento será Xiufeng Li, um estudante de doutorado do último ano do meu laboratório. Comece com a configuração da iluminação óptica para o sistema microscópico usando um laser de estado sólido bombeado por diodo com um comprimento de onda de 266 nanômetros como fonte de excitação. Instale duas lentes convexas para expandir o raio laser e coloque um orifício perto do ponto focal da primeira lente convexa para filtragem espacial.
Use um espelho galvanômetro 1D para refletir o raio laser para cima. Com a ajuda da lente objetiva, concentre o raio laser em uma amostra. Fixar o UT focado em anel com a área ativa voltada para cima em um tanque de água feito em laboratório com uma janela opticamente transparente na parte inferior coberta por um fino deslizamento de quartzo, em seguida, anexar o tanque de água a um estágio manual de dois eixos do microscópio para controlar a posição lateral do UT. Quando feito, ligue o laser UV e ajuste a posição do UT para permitir que o raio laser passe pelo centro do UT, em seguida, desligue o laser UV e encha o reservatório de água com água desionizada para imergir totalmente o UT. Conecte a saída do UT a dois amplificadores para obter um ganho total de 56 decibéis e, em seguida, conecte a saída do segundo amplificador a uma placa de aquisição de dados, ou DAQ, instalada no computador.
Em seguida, conecte um suporte de amostra a um estágio manual de eixo z conectado a estágios motorizados de xy seguido pela colocação de quatro pedaços de fita dupla face ao redor do orifício vazio do suporte de amostra. Mais tarde, proceda a alinhar o sistema anexando fita preta a um slide de vidro e, em seguida, colocando o slide de vidro para cobrir o orifício do suporte de amostra com a fita preta voltada para baixo. Depois de pressionar o deslizamento de vidro no suporte da amostra, baixe o suporte da amostra para imergir o deslizamento de vidro na água.
Desconecte o UT em forma de anel e os amplificadores, em seguida, conecte o UT ao pulsar/receptor e a saída do pulsar/receptor a um osciloscópio. Opere o pulser/receptor no modo de eco de pulso com a amplitude de pulso de seis e o ganho em 20 decibéis. Uma vez definidos os parâmetros, ajuste a posição z do suporte da amostra, defina a posição do plano focal acústico onde os sinais ultrassônicos são máximos.
Altere o pulso/receptor para o modo de transmissão antes de definir o ganho para 60 decibéis, em seguida, habilite a saída do laser e ajuste a posição z da lente objetiva para maximizar os sinais fotoacoustic ou PA medidos pelo osciloscópio. Para tornar o sinal de PA gerado simétrico e máximo, ajuste a posição lateral do UT em forma de anel e, em seguida, ajuste a posição z do suporte da amostra para maximizar os sinais de PA. Repita os ajustes para a posição z da lente objetiva e o suporte da amostra para otimizar a simetria e amplitude dos sinais de PA.
Quando os sinais de PA forem otimizados, regissuque o atraso de tempo ou o tempo levado pelas ondas de AF para alcançar o UT no osciloscópio. Mova o suporte de amostra para imagem de diferentes posições da fita preta. Ajuste o achatamento dos suportes de amostra, de modo que os sinais de PA gerados a partir de cada posição da fita preta tenham o mesmo atraso de tempo que o medido anteriormente.
Depois que o alinhamento do sistema estiver concluído, desligue o laser e conecte o UT aos dois amplificadores. Para preparar uma fatia cerebral de rato fixa e parafina, fixou o cérebro colhido em formalina tamponada 10%. Após 24 horas, processe o cérebro fixo por desidratação com álcool classificado, limpando com xileno e incorporando com parafina.
Use um microtómeo para obter cinco fatias de espessura de micrômetros do cérebro incorporado. Coloque as fatias de amostra nos slides de quartzo para secar em um forno a 60 graus Celsius por uma hora. Mais tarde, desesfinar as seções cerebrais com um agente de compensação para evitar altos sinais de fundo de parafina.
Para preparar uma fatia cerebral de rato fresco, lave o cérebro do rato colhido com PBS e, em seguida, corte uma fatia de cinco milímetros de espessura da amostra cerebral por mão seguida de lavar a fatia cerebral com PBS para remover o sangue na seção transversal. Para a colocação da amostra, prepare um tanque de amostra feito em laboratório com uma membrana de polietileno transparente UV com uma espessura de 10 micrômetros, em seguida, adicione uma gota de água à membrana e coloque a amostra biológica no tanque de amostras para cobrir a água. Em seguida, coloque a amostra contendo o tanque no suporte da amostra, garantindo cobrir o orifício vazio do suporte da amostra.
Defina o laser UV para o modo de gatilho externo e use o programa de visão de laboratório construído em laboratório para definir os parâmetros de varredura conforme descrito no manuscrito. Inicie a varredura de ensaio em uma pequena região, definindo o número de passos móveis dos motores x e y-axis e, em seguida, ajuste o estágio manual do eixo z para colocar a amostra no plano focal para obter sinais máximos de PA. Depois de mover os motores x e y-axis para o ponto de partida desejado e definir a região de digitalização definindo os valores xn e yn, inicie o programa de aquisição de imagens.
Quando as imagens forem necessárias, desligue o laser e remova o suporte da amostra. Armazene tecidos biológicos frescos em formalina tamponada 10% neutra. Use os sinais pa coletados para reconstruir a imagem de projeção de amplitude máxima com a ajuda de um algoritmo de processamento de imagem construído em laboratório.
A análise representativa mostra as imagens UV-PAM e H&E de uma fatia cerebral de camundongos FFPE. Na imagem UV-PAM ampliada, os núcleos celulares individuais poderiam ser resolvidos. Os núcleos celulares correspondentes foram encontrados nas imagens padrão manchadas de H&E, mostrando a alta precisão do sistema atual para imagens celulares.
Um algoritmo de aprendizagem profunda foi aplicado para transferir a imagem UV-PAM em escala cinza para uma imagem virtual manchada de H&E. É importante ajustar a posição do transdutor ultrassônico em forma de anel para permitir que a luz UV passe por um centro durante o alinhamento do sistema. Isso garante que um sinal fotoacástico detectável possa ser obtido e otimizado quando o laser estiver ligado.
Nosso algoritmo de classificação pode ser incorporado ainda mais para classificar tumores e regiões normais nas imagens, servindo como uma imagem assistiva e uma plataforma de diagnóstico para profissionais médicos.
