このプロトコルは、ショウジョウバエの蛹の結節に対して、以前に傷付けられ、ライブイメージングされた後でも、組織のアーキテクチャを混乱させることなく免疫組織化学を行うことを可能にするため、重要です。この技術により、すでに利用可能な幅広い抗体染色を利用して、結節上皮の細胞、構造、およびタンパク質を染色することができます。この手法を免疫化学やDNA染色に利用しています。
しかしながら、この解剖は、in situハイブリダイゼーションなどの他の技術の出発点として使用することができる。蛹は小さくて繊細であるため、このプロトコルは難しい場合があり、解剖を行うには安定した手が必要です。そして、それは経験で簡単になるので、重要なものの前に重要でない蛹で練習してください。
まず、ステージP5で解剖スコープを使用して3〜4匹の蛹を慎重に取り除き、テープの横にある顕微鏡スライドに集めます。次に、蛹を少なくとも1つの蛹幅を離してテープの上に置き、腹側を下にします。次に、接着剤の滴をパラフィンフィルムの上、または遠沈管の蓋に入れます。
次に、0.1〜10マイクロリットルのピペットチップの端を接着剤の滴に浸し、カバースリップでピペットチップをコーナーから1センチメートルずつ2回タップし、蛹の長さの約半分の接着剤のラインを作成します。次に、P2ピペットを2マイクロリットル、P200ピペットを200マイクロリットルの容量でプリセットし、チップでフィットさせます。次に、頭の側面の近くに鉗子を挿入し、前部から後部にかけて、できるだけ多くの瞳孔ケースを静かに取り外します。
次に、一対の鈍い鉗子で蛹の発達中の脚をつかみ、慎重にそのケースから蛹を引き抜きます。カバースリップの隅に蛹を置きます。鈍い鉗子で後腹部、または発達中の翼の蛹をつかみます。
蛹の腹側を持ち上げて、接着剤のラインに入れます。P2ピペットを、0.1ミリモルのカルシウムを含む2マイクロリットルの単一強度PBSで素早く満たし、それを空気中に保持し、先端に小さな気泡を形成するのに十分な程度に排出する。胸郭の基部にある蛹の片側に溶液の小さな泡に触れ、次に反対側で手順を繰り返します。
次に、P200ピペットに200マイクロリットルの単強度PBSと0.1ミリモルのカルシウムを充填し、ピペットの先端を胸郭の上に置き、内容物を排出して蛹を完全に沈めると、残りの接着接着剤はすぐに固まります。次に、約100マイクロリットルのPBS溶液を除去して、蛹がかろうじて水没するようにしてから、すぐに次のステップに進みます。ノータムを解剖するには、一対のマイクロ解剖ハサミをつかみ、ハンドルの片側を利き手の人差し指と中指に押し付けて、利き手の親指が切削力を加えるようにします。
次に、非利き手の中指に対してハサミの首を安定させ、カバースリップを補強しながら、非利き手の薬指で安定させる。次に、背腹部の中央を刈り取って、約0.2〜0.5ミリメートルの小さな穴を作ります。背部組織を単離するには、外皮を後部から前部まで0.5〜0.75ミリメートルの小さな切り込みを入れ、最後には背部組織を包囲する。
さらに、蛹の反対側で後から前への切り傷を繰り返す。解剖ステージを回転させ、必要に応じてヘッドをきれいに切断できるようにします。ノータムが簡単に移動されているかどうかを確認して、ノタムが分離されているかどうかを確認します。
カバースリップの中央に約200マイクロリットルの単一強度PBSを加え、ピペットチップをカバーガラスを横切って静かにドラッグして、元の解剖液滴に接続するチャネルを作り、新しい液滴から元の液滴に。一対の鈍い鉗子を使用して、孤立したノータムをカバースリップの中心に静かに押したりドラッグしたりして回転させ、内部側が上を向くようにします。腹部または頭部に押し込んで、鈍い鉗子でノータムを押し下げます。
一対の鋭い鉗子と単強度PBSの穏やかな排出を使用して、200マイクロリットルのピペットから、残りの脂肪体、筋肉バンド、またはヘムリフトを除去し、単層上皮を完全に露出させた。組織がきれいになったら、200マイクロリットルのピペットを使用してできるだけ多くのPBS溶液を除去し、解剖スコープで監視して、小目が吸引されないようにします。最大限の液体除去後、吸収組織を使用して、カバースリップ上の残りの接着剤、瞳孔死体、およびその他の破片を慎重に拭き取ります。
次に、150〜200マイクロリットルの4%PFAを加え、室温で20分間固定する。そして解剖速度に応じて、最初の蛹が別々のカバースリップに固定されている間に、さらに1〜3匹の蛹を解剖することができます。PFAを取り出し、これを単強度PBSと交換し、30秒間に1回ノータムを洗浄した。
抗体染色を進める場合は、5分間洗浄を3回行い、単一強度PBSまたはPBST中で、抗原が細胞内であれば組織を透過処理する。サンプルは、加湿チャンバー内で一晩0.02%アジ化ナトリウムを含む単一強度PBSに保存することができる。染色後、トッパーと呼ばれる新しいカバースリップを支持体とともに準備する。
トッパーの中央に約 1 cm 離れた 22 x 22 のカバー スリップから作られたスペーサーを使用して、約 200 マイクロメートルのギャップを作成します。接着するには、スペーサーの継ぎ目を中心から最も遠い、マニキュアの薄い層で塗り、乾燥させます。サンプルからできるだけ多くの水溶液を取り出し、直ちに2滴の退色防止マウント媒体をサンプルに塗布します。
必要に応じて、清潔で鋭い鉗子を使用して、色あせ防止マウント媒体液滴の中心にノータムを配置します。カバースリップをノータムとともに約10×40ミリメートルのフォーム支持体の上に置き、サンプルが作業面に付着しないようにサンプルを持ち上げます。解剖スコープの下で、トッパーをサンプルの上にゆっくりと下げます。
退色防止マウント媒体がトッパーに当たったら、静かに離し、毛細管現象がトッパーを下に引っ張るようにします。別のフォームをトッパーの上に置き、標準的な顕微鏡スライドを重りとして使用して、サンプルカバースリップ、トッパー、スペーサーの間に退色防止マウント媒体を静かに同軸にします。5~10分後、吸収組織を使用して、カバースリップの端にそっと触れて、余分な退色防止マウント媒体を吸い取ります。
カバースリップの各角にマニキュアをそっと塗り、密着させます。カバースリップがずれて背部組織を傷つけないようにするには、まずエッジのコーティングを避け、コーナーのマニキュアが乾いたら、カバースリップのすべてのエッジをペイントしてシールします。このプロトコルは、抗体および細胞染色剤を使用して、固定サンプルのイメージングを可能にする。
このプロトコルは、以前に傷付けられ、ライブ画像化されたサンプルで使用できます。ライブ画像と固定画像を比較すると、プロトコルが組織アーキテクチャおよび形態を保存することが示される。このプロトコルは、解剖されたnotumの異なるビューを可能にする。
頂端ビューは、キューティクルの下の上皮細胞の境界と核を視覚化するのに理想的です。基底図は、創傷縁における基底構造をよりよく明らかにする。解剖中に結節を曲げたり反らせたりしないでください。
横端を避けて平らな部分を切断します。腹側に近づきすぎないようにしてください、さもなければそれは取り付けの間に変形するでしょう。瞳孔を解剖した後、電子顕微鏡や断面など、他の多くの技術を適用することができます。
これらの技術により、以前に画像化された構造を非常に詳細に調査することができます。
