The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

倫理声明： このプロトコルに記載された実験手順は排他的にキイロショウジョウバエと協力し、ドイツの動物福祉法の対象ではありませんことを含む。 メディア、ツール、ハエの作製<ol><li>重炭酸カリウム17なしに変更された市販の粉末のM3成長培地を準備します。注意：目や皮膚に刺激を与えます。 10％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン及び100μg/ mlストレプトマイシンを含む培地を補う。最良の結果を得るための熱不活性化し、昆虫培養テスト済みウシ胎児血清を使用してください。 -20℃で一定分量が0.2μmボトルトップフィルターユニットと店舗を通じて（中と呼ぶ）完全培地をフィルタリングします。使用前に、フィルター（0.2μmのシリンジフィルターチップ）培地は再び沈殿物を除去した。 </li><li>薬理学的アッセイのための阻害剤ストック溶液を準備します。 Dissol一定分量の適切な溶媒およびストア内の化学物質をVEの。 （：目や皮膚を刺激する。注意）のジメチルスルホキシド例えば、28.69 mMのアナカルド酸の原液を調製。 </li><li>解剖し蛹精巣および単一の嚢胞の切開の破壊のためのツールを準備します。 2シャープで硬い針ではなく、ピンセットを使用してください。一対の鉗子の2つのアームの間に発症する毛管力は、媒体の少量の単一の嚢胞の切開を非常に困難にする。例えば、接種ループホルダーに挿入されたステンレス製の虫ピンの先端を使用しています。 </li><li>成虫（ 約 40〜60ハエ）の十分な数の適切に熟成蛹、種子の約 10大型培養バイアル（4cmの直径を有するチューブ）を得るために。 HPのスイッチを分析するには、それらの内因性パターン12,16,22にH2AvD-RFPとProtamineB-EGFPを発現しているハエを使用しています。 25で標準条件下でバイアルをインキュベート;まで4-5日3齢幼虫のクロールされるまで、約のためのC°およびバイアル25の壁に蛹化を開始します。 </li></ol> 2解剖のために24時間齢の蛹の入手ホワイトプリ蛹マーキングまたは収集<ol><li> HPのスイッチ上の特定の化学物質の影響をテストするために、 約 24時間のAPF 12で蛹精巣を解剖。上演蛹を取得するには、幼虫をpupatingでプリペアフライ培養バイアルを取る（セクション1.4を参照）、できるだけ多くの白人前蛹を識別します。蛹化中の一番最初のステップの間に前蛹は動かず、無給電、裏返した気門及び白色蛹殻とむしろ短くなる幼虫として表示されます。蛹殻は蛹開発26の次の段階を示しており、30〜60分以内に黄褐色になる。 </li><li>バイアルの外側に油性マジックで事前に蛹の位置をマークします。 約 24時間25℃でバイアルをインキュベートする。 <ol><li>別の方法として、PBS緩衝液で湿らせた小さなブラシでバイアルの側面から前蛹を選択します。その後、新しい50mlの反応管の側に予め蛹を転送し、 約 24時間25℃でインキュベートする。 </li></ol></li></ol>蛹の形成後に、約 24時間で蛹精巣の3解剖<ol><li> 10cmのプラスチック製の細胞培養やシャーレ上の培地を数滴（ 約 80μlの各）を配布します。鉗子の幅広いペアまたは培地で湿らせたブラシを使用して、培養したバイアル（セクション2を参照）から24時間のAPF段階で蛹を選択します。ディッシュ上の培地の各ドロップに1さなぎを転送します。 </li><li>解剖のために、光ファイバ照明装置を装備した実体顕微鏡を使用しています。これは、培養中の適切な発達を妨げる可能性があるため、切開中に室温より精巣を加熱しないでください。 <ol><li> 5号鉗子2対の蛹を解剖。 1組では、その最も後方で蛹をつかむパート（後部気門）と位置に保持。 </li><li>鉗子の他のペアで、前気門をつかみ、その前端で蛹蓋を開きます。胸部の少なくとも一部が露出するまで蛹のケースをはがし。 </li><li>その最も後端によって所定の位置にサナギを押し続けます。蛹の内圧を解放するには、蛹の頭部領域に鉗子の両アームを挿入します。 </li><li>鉗子を開いて前方方向に鉗子を移動させて開いたさなぎをリッピング。この移動に伴って生成された開口部は最初の試みで、可能な限り大きいことを確認してください。これは精巣が小さい開口部から直接押され、そして最も頻繁に中断されるのを引き起こす可能性があるため、圧力が解放される前に、その後方端で蛹に損傷を与えないようにしてください。 </li><li>蛹が開かれると、蛹の放出された内部圧力がラを通して脂肪体細胞や組織の凝集体を押したことを確認頭部領域におけるRGE開口部。蛹の精巣は、すでに本資料によって蛹から押し出されているかどうかをチェックします。これが発生する場合がある。精巣は、24時間のAPFで、他の組織に接続されていないため、蛹23から容易に排出される可能性があります。 </li><li>彼らは蛹に残っている場合、これは精巣に損傷を与える可能性があるため、鉗子でサナギを圧迫しないようにします。鉗子の1ペアを使用して開口部のサイズを大きくします。 </li><li>そして、その最も後方の端で蛹を保持します。蛹から精巣を解放するために前方に後方から蛹の中身うち他のピンセットと静かに連勝を閉じます。 </li></ol></li><li>プレカット200μlのピペットチップにそれらを引いて、精巣を収集します。精巣で転送脂肪体細胞の数を減少させるために、媒体のごく少量を転送しよう。新鮮な培養皿に培地中に精巣を配置します。少数の脂肪体細胞になるまで培地で精巣を数回洗浄するsが残っている。 </li><li>ライブイメージングのために、媒体をガラスボトム培養ディッシュに精巣を転送し、倒立イメージング顕微鏡を使用しています。薬理学的アッセイのために、ステップ5に進みます。 </li></ol>男性生殖細胞の嚢胞とライブイメージングの4解剖<ol><li>ガラスボトム培養皿に1つまたは複数の蛹の精巣を転送します。 </li><li>光ファイバ照明と2つのステンレス鋼の針付き実体顕微鏡を使用して、男性の生殖嚢胞の解剖のため（1.3節を参照）。 <ol><li>一方の針を使用すると、慎重にその前方または後方端部に1つの精巣を突き止めるようにしてください。位置でそれを保持します。精巣に他の針を挿入し、横に針を移動させることにより、精巣鞘を混乱させる。嚢胞の多くは、この移動によって精巣から解放される。 </li><li>一方の針との位置に精巣を押し続けます。他の針で精巣からの残りシストアウト優しく連勝。 </li><li>紳士で区切り集約さ嚢胞のどちらかLYは、嚢胞のクラスタを介して、または200μlのピペットチップを用いて培地を新鮮な培養皿に嚢胞を転送することによって横に針を移動させる。 </li></ol></li><li>単一の嚢胞のライブイメージングのための倒立イメージング顕微鏡に培養皿を移動します。必要に応じて、針で再び嚢胞を分散させる。 <ol><li>位相コントラストおよび蛍光顕微鏡を使用して嚢胞の段階を特定する。 </li><li>所望の段階の嚢胞に焦点を当てています。嚢胞は、培養皿の底に付着し、そのためピントて浮動する傾向がないように、より長いイメージング実験中に頻繁に嚢胞の焦点と位置を確認してください。 注：固定化のためのポリ-L-リジンで皿をコーティングする初期の生殖系列嚢胞の発達に有害である。その代わりに、個別の嚢胞を単離することができる。いくつかの練習で、それは非常に静かに針でそれを押すことによって、特定の嚢胞を選び出すことが可能である。これは、単一の嚢胞の転送がカルトを分離することができるようになります顕微鏡の視野に収まる引き出し先端がガラスパスツールピペットでUREの料理。単離された嚢胞がその後も容易に長期のインキュベーション後に培養皿に再配置することができる。 </li></ol></li></ol>無傷蛹精巣を持つ5。薬理学的アッセイ<ol><li> 12回の反復の一つの実験のための培地500μlを24ウェル細胞培養プレートの各ウェルを埋める。プレカット200μlのピペットチップを用いて、各ウェルに一つの蛹の精巣を転送する。 <ol><li>倒立蛍光顕微鏡を用いて、単離された精巣におけるプロタミンの存在を確認してください。精巣は、HPのスイッチは嚢胞のいずれかで行われていないことを示していますProtamineB-EGFP信号のないものでなければならない。すでにProtamineB-EGFP陽性嚢胞を示して精巣を交換してください。 </li><li>最初の12のウェルに、所望の最終濃度に達するように希釈した阻害剤化合物（アナカルド酸）を含有する培地500μlを追加ウェルあたり1mlの培地中で（150μM）。未処理のコントロールとして残りのウェルを使用します。阻害剤化合物と同様に使用する溶剤の同量の培地500μlを加える。注：多くの異なる化合物および溶媒を使用する場合、それはコントロールとして培地のみを使用し、別個の実験において溶媒濃度を増加さの影響を試験するために、より効率的かもしれない。 </li></ol></li><li>暗闇の中で24時間、25℃でプレートをインキュベートする。 </li><li>上記のようにインキュベート精巣でプロタミンの存在をもう一度確認してください。制御精巣は現在、HPのスイッチを介して遷移を示す一つ以上のProtamineB-EGFP陽性嚢胞を示すべきである。 </li><li>他の場所12,27,28説明したように200μlの先端でピペットを用いて、ポリ-L-リジンコートスライドに精巣を転送、スカッシュ準備をして、適切な蛍光抗体で染色する。 </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+stable+cell+lines+of+Drosophila+germ-line+stem+cells.">Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells.</a> PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).</li><li>Church, K., Lin, H. P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubules+and+chromosome+movement+during+prometaphase+in+Drosophila+melanogaster+spermatocytes+studied+in+life+and+with+the+electron+microscope.">Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope.</a> Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes.">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Live+Imaging+of+Stem+Cells+in+Drosophila+Testis.">Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).</li></ol>

著者らは競合する利益を有していない。

提示されたプロトコルは、特定の発達段階でのショウジョウバエ精巣および単一生殖細胞嚢胞を分析する能力に、培養皿の中でこれらの細胞および組織のex vivoでの開発の両方に基づいて、2つの異なるアプリケーションを記述します。一つの用途は、精子の発達中の重要なプロセスの薬理学的操作である。重要なことは、これは簡単にハエ遺伝学に基づいて機能解析を使用して得られていません減数分裂後の精子形成へのアクセスを可能にする。他のアプリケーションが生きていると生殖細胞および精巣の開発の顕微鏡観察である。 RTで、通常の雰囲気下で生き残り、発展させる培養中のショウジョウバエの細胞や臓器の能力から、特にこのアプリケーションの利点。したがって、加熱されたステージ（25℃の標準的育種温度に加熱）を装備した倒立イメージング顕微鏡はライブイメージング実験に意味のある結果を得るのに十分である。さらなるライブイメージングのための蛍光タンパク質タグ付きタンパク質を発現するより、多くのトランスジェニックハエ株は存在しないか、容易に確立することができる。 蛹の精巣または特定の発達段階の生殖嚢胞を得るためには、一つは、ショウジョウバエの発達のタイミングに精通していることが重要です。各ステージの正確なタイミングは、実験室の中で培養条件を変化させると、株を飛ぶ、経験的に確立されなければならない場合があります。上記で概説したように、これは、例えば、HPスイッチを標的、薬理学的アッセイにとって特に重要である。タイミングが一つでも集団内でわずかに変化することができますので、このような実験のために、それは常に、実際の阻害剤試験前ProtamineB-EGFP信号と精子細胞を確認することをお勧めします。 上記のプロトコルに続いて、添付の脂肪体組織の自由な無傷の器官として初期の蛹の段階から精巣を解剖するために、実験を有効にする必要があります。これらの精巣および、なおさら、孤立したGERM-ライン嚢胞は非常に壊れやすいものです。したがって、鉗子、針、およびピペットを用いて精巣および嚢胞を処理し、転送するのに必要な手先の器用さと経験を開発することが重要です。特に減数分裂および初期減数分裂後の生殖細胞発達を標的とする研究は、この恩恵を受ける。それは成人の精巣から長い鞭毛後期精子細胞の嚢胞を分析することは比較的容易であるが、それは初期段階を得ることが困難である。このプロトコルに従って、初期の蛹の精巣からこれらの嚢胞を解剖すると、はるかに効率的です。通常のハエ株で、蛹のわずか約 50％が男性であることに留意してください。そのため、必要な精巣の数と、少なくとも倍の蛹を解剖するための準備。或いは、精巣無傷幼虫23,34の横方向の脂肪体組織に埋め込 ​​まれたような半透明の円形の器官を同定することができるように、立体顕微鏡を用いて雄L3幼虫を識別するために、新鮮な培養バイアル中にそれらを収集することが可能であること缶ステージングおよび解剖のための前蛹を選択するために使用される。それは、男性のプレ蛹35を識別することも可能である。 また、以前に18報告されている単離された生殖嚢胞や文化にそのまま蛹精巣の両方が、光に敏感であることに気づいた。この光感度も薬理学的アッセイで使用されるいくつかの化合物のために保持しているかもしれません。したがって、インキュベーションの間に暗闇の中でアッセイの培養皿を維持することが最善です。開発精巣および、とタイムラプスイメージング実験を計画する際に同様に、特に、孤立した嚢胞は、あまりにも長い露光時間および/ ​​またはすぎる高いサンプリングレートはex vivoでの開発を阻害する可能性に留意してください。適切なサンプリングレートは、実​​験的に決定されるべきである。 培養皿中の細菌および/または真菌感染症および過成長が深刻な問題となる。あまりにも多くの細菌に感染した培養皿は、ex vivoで DEVEをサポートしていません精巣および嚢胞のlopment。したがって、記載の培養培地は（ステップ1.1参照）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むが、長期のインキュベーションの間に、これらの抗生物質が低下する可能性があり、それらの活性が減少するかもしれない。これは、上記のプロトコルを使用した場合に観察培養した嚢胞の生存の限られた時間の理由の一つ（最大72時間）である可能性があります。まだこの時間枠は、皿中の培養培地を定期的に交換することによって拡張することができなかった。私たちは、他の要因がそのような生殖管の他の組織からの増殖シグナルの欠如として、培養中の生存に影響を与えるかもしれないと結論付けている。一方、減数分裂後の開発は、哺乳動物におけるよりもショウジョウバエの高速です。 ショウジョウバエでは、精子は、約90時間を要し、HPのスイッチは、減数分裂9,12後に50〜60時間の間で行われる。このように、このプロトコルを用いて達成周り48時間の通常の生存時間はSPEにおいて極めて発達過程に従うことが非常に適しているそのような減数分裂またはHPのスイッチとしてrmatogenesis、。細菌や真菌の汚染がきれいなツールやメディアを使用することで回避できますが、提示されたプロトコルは、ハエのため、厳密に無菌労働条件を利用し、標準的な条件下で飼育するとき睾丸は既に細菌が含まれて飛ばない。それにもかかわらず、この培養技術のいくつかのアプリケーションは、（プロトコルのために、17,36,37を参照）無菌条件下で解剖したり、隆起したハエの恩恵を受ける可能性があります。 薬理学的アッセイは、さまざまな酵素の阻害剤または活性化因子として機能する化学化合物の使用に依存します。一般的にこのような実験において使用される化合物は、しばしばそれらの標的特異性が大きく異なる。利点としては、これは、アナカルド酸阻害P300 / CBP、PCAF、帽子38のMYSTファミリーのメンバーと、例えば、全体の酵素クラスをターゲットにする可能性を提供しています。これの欠点は、潜在的なオフターゲットまたは細胞傷害効果inducかもしれないそのような化合物によって編したがって、蛹精巣や嚢胞を用いたアッセイで使用される各化合物は、その細胞毒性及び異なる濃度で特定の効果をテストする必要があります。また、培養条件、化合物濃度または活性、および細胞透過性の変化に多少のばらつきが誘導される効果のばらつきにつながるかもしれない。したがって、各実験における治療の成功を監視する必要がある。私たちは、150μMでアナカルド酸を使用した場合に、ヒストンH4のア​​セチル化は一貫して減少している間たとえば、私たちは、間に、時にはいくつかの精巣内のクロマチン凝縮表現型の強度に多少の変動を観察した。 培養物中のショウジョウバエ精巣で薬理学的ア ​​ッセイは、精子形成4,12,14,21の前後の減数分裂のメカニズムを分析するために使用されてきた。それはエッセンで選手を標的とするために、遺伝的ツールで減数分裂後の精子形成にアクセスすることは困難であるためLの前減数分裂と減数分裂の機能は、このex vivoでのアプローチは、代替手段を構成している。また、原理的には、本方法は、経時的な処置生殖細胞の発達を追跡するパルスチェイス実験に適合させることができる。しかし、私たちはまだこの可能性をテストしていません。初期の蛹精巣の使用を作ることは薬理学的アッセイで有利である。まず、（24時間APF前後）若い蛹精巣の薄い外側シースは、化合物の改善された透過性を可能性があります。減数分裂後のHPのスイッチを研究するときに、第2、蛹精巣は、HPのスイッチには影響されたかどうかを直接読み出しを可能にするプロタミン-GFP発現フライラインから24時間のAPFで解剖した。 現在までのところ、精巣および生殖系列嚢胞を含むショウジョウバエの器官や組織のex vivo培養のためのいくつかのプロトコルが開発されている（ 例えば 、4,14,17,20,39,40を参照のこと）。培養培地および使用される一般的な条件1979年に設立されたここで紹介するプロトコルで17。培養系は、後に成人の精巣4から分離された後期減数分裂後の嚢胞で個別化機構のin vivoイメージングに適合させた。以前は、私たちはこれらの条件はまた、周りの48〜12時間のために彼らの嚢胞で減数分裂や早期減数分裂後の生殖細胞の生存と分化を支持することを報告した。他の培養システム19とは対照的に、これらの培養物において観察された発生のタイミングは（詳細については、12を参照） を固定したサンプルから決定されたタイミングとほぼ一致した。 H2AvD-RFPおよびプロタミン-GFP蛍光シグナルは培養中の生殖細胞の核形態およびクロマチン組成物を可視化するために使用することができる。私たちは、培養中の発達段階の明確な識別のために、このような嚢胞のコイリングなどの他の基準、より有利であることがわかった。重要なことは、提示されたプロトコルは、フライ内線の添加を伴わないウシ胎児血清以外RACTまたは他の増殖因子。さらに、本 ​​発明者らは、条件がエキソビボ培養における減数分裂の蛍光顕微鏡画像と互換性があることをここに示す。画像は、長期的発展をサポートする使いやすい培地中で妥当な解像度を得ることができる。これはVoltalef油41,42に短期間（ 約 3時間）の観察を可能にするプロトコルとは対照的である。 栽培や蛹精巣およびシングル男性生殖嚢胞の薬物治療のための上記の手順は、 ショウジョウバエの精子形成に研究することができる多くの遺伝的、エピジェネティックな、生物学的細胞、または発生の質問に簡単に適応可能である。これは、生殖系列幹細胞に着目し、特に研究を含む。それは、20,43精巣幹細胞の発達を培養成体のライブイメージングを続けることができることが示されている。しかし、成熟した精巣の蠕動運動sheathは画像取得を妨害する。したがって、いずれの画像化は、断片化精巣43または行わイメージング実験の数は、失われたデータセット20を考慮して大きくする必要があるを使用して行われる。初期の蛹精巣（24時間APF）は、まだ筋肉細胞に同封されていません。でも、少し古い精巣（36-45時間のAPF）は、いくつかの蠕動運動を表示します（ 図3、補足ビデオ1を比較する）ように見える。したがって、無傷の臓器若い蛹精巣の栽培は、代替となりうる。 また、一度、蛹精巣を分析するために、最終的には孤立した生殖細胞嚢胞が小さく、細胞集団にもかかわらず、均質の源として、単一の嚢胞を使用してさらなる応用を可能にする能力を習得。すでに実証されているように、例えば、それは、精子形成の定義された段階において特定遺伝子の転写調節を分析するためにRT-定量PCRを実行することが可能である<suP&gt; 15。

多くの種の雄性生殖細胞の発達は、連続プロセスである。これは、形態学的およびエピジェネティックに専門性の高い精子の形成に絶頂に達する重要な一連の事象によって特徴付けられる。 キイロショウジョウバエでは、精巣デバイドの先端の生殖系列幹細胞は非対称的に新たな幹細胞と精原細胞を生じる、 すなわち、分化に努めて娘細胞（概要については図1を参照）1,2 。精原細胞は、減数分裂の開始と、印象的な成長と転写活性の位相が精母細胞期と呼ばれる、有糸分裂の4ラウンドを受け、。 1精原細胞由来の細胞が互いに接続二つ体細胞、嚢胞と呼ばれる構造でラップされた同期化されたバンドルとして開発残る。減数分裂の完了後に、雄性生殖細胞の形態は、完全に再編成（ 図1に概略的に示される）。最初に、円形精子細胞は、流体力学的なヘッド構造を形成するために細長く、そして鞭毛を発現する。 5 -最終的に、精子細胞は、個別3と呼ばれる複雑な、アポトーシス関連機構によって互いに分離されている。 9 - キイロショウジョウバエと哺乳動物種を含む多くの種では、半数体雄の生殖クロマチンの著しいエピジェネティックな再配置を伴う生殖細胞の形態学的変化は、（HPのスイッチ）6ヒストンからプロタミンスイッチと呼ばれる。おそらくほぼすべての標準的なヒストンおよび多くのヒストン変異体分子は、DNAから取り除かれ、成熟精子のクロマチンに特有の非常にコンパクトなヌクレオプロタミンの構造が得られる小型の塩基性タンパク質、プロタミン、に置き換えられます。 HPのスイッチの一般的特徴は、Tである彼最初のヒストン変異体による、その後の移行タンパク質による、最後にプロタミンによる正規のヒストンの交換。 12 -このすべては、ヒストン脱7,10の直前に、ヒストンH4のアセチル化レベルの急増などのエピジェネティックマークにいくつかの変更が添付されています。 全てではないが大部分は、上述した処理により、成熟した、完全に稔性精子の発達に必須である。これは、哺乳類の精子形成共有として、無脊椎動物のシステム1,8,9との類似、かなりの量のショウジョウバエでなく、人間だけでなく真実である。雄性生殖細胞の発達を研究することは大いにショウジョウバエモデル系において促進される。ハエは、遺伝的に非常にアクセス可能です。突然変異体の世代だけでなく、融合遺伝子またはRNA干渉構築物を発現するハエ株の確立は、少し手間がかかります。しかし、減数分裂後の精子形成の研究では、突然変異体の使用ANdは単純な遺伝子ツールが限界に達する可能性がある。 ショウジョウバエの精子形成において、転写は、減数分裂に入ると、ほぼ完全に停止する。 16 -このように、減数分裂後の精子形成は、主に拡張された減数分裂前期13で合成され、翻訳抑制され、保存されたmRNAに基づいています。そのため、RNA干渉または非条件付き突然変異体の利用のようなツールは、具体的にも前減数分裂または減数分裂生殖細胞の開発に不可欠な機能を果たす遺伝子産物の減数分裂後の役割を研究するのに適していない。 20 -このような場合に利用することができるショウジョウバエの一つの利点は、培地4,12,17にex vivoで開発するための解剖無傷精巣および生殖細胞のさえ嚢胞の能力である。精巣や生殖系列嚢胞の切開、培養を生細胞における生殖細胞の発達だけでなく顕微鏡観察を可能にするが、そのようなヒストンアセチルトランスフェラーゼグッズ（帽子）、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）、トポイソメラーゼ、またはプロテアソームの酵素複合体の阻害剤、例えば 、薬理学的ア ​​ッセイの使用LSO。これにより、減数分裂後の精子形成の際に酵素機能を操作するためにかかわらず、胚性減数分裂前、又は減数分裂の機能4,12の発達の結果を監視することが可能である。 薬理学的ア ​​ッセイでは、以前に減数分裂前期中のブロモドメインタンパク質のアセチル化に依存するローカリゼーションだけでなく、帽子やHDACは12,21をターゲットに特異的な阻害剤を使用して、減数分裂後の精子形成におけるエピジェネティックなHPのスイッチのヒストンアセチル化レベルの関連性を分析した。これらのアッセイにおけるHPのスイッチを標的とすることは融合遺伝子histone2AvD-RFPと内因性パターンのprotamineB-EGFP 12,22を表現するハエ株を使用することにより可能となり、観察したこと蛹精巣の最初の精子細胞は、24および48時間APF 12の間、HPのスイッチを通過します。 提示されたプロトコルは、 ショウジョウバエの蛹、培養条件、および無傷の蛹精巣を持つ薬理アッセイからの精巣および嚢胞の解剖を説明しています。この目的のために、蛹殻形成（APF）と、約24時間で蛹の精巣を解剖している（ 図1および2を参照）。この時、精巣は他の組織への接続を行っていないと阻害剤化合物23,24によって、より良い浸透を可能にする唯一の薄い外側シースに囲まれている。精巣は簡単に文化に撮影することができBean管理や洋ナシの形の器官です。これらの精巣を培養し、解剖し、そして特異的な阻害剤で処置される。続いて、阻害剤の効果は、免疫蛍光分析し、融合タンパク質発現の蛍光顕微鏡を用いて監視され、核モルホリンの比較により未処理の生殖細胞のものと処理された生殖細胞のOGY。このプロトコルで提示条件も培養中の精巣および生殖系列嚢胞を開発するライブイメージングを可能にする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Anacardic acid</td>
			<td style="width:105px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:99px;">172050</td>
			<td style="width:247px;">brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-acetyl-Histone H4</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-598</td>
			<td>brand: Upstate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioCam MRm&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioObserver.Z1 inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont 5-Inox forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fiber optical&#160; illuminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inoculation loop or pin holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5018</td>
			<td rowspan="2" style="width:247px;">In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5014</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plates, 24-wells</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>351147</td>
			<td>brand: Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen Strep</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>15070</td>
			<td>brand: Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shields and Sang M3 Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stemi SV6 binocular</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

哺乳類におけるおよびキイロショウジョウバエにおける精子形成の間に、雄の生殖細胞は、本質的な発達過程の一連の開発しています。これは、幹細胞集団、有糸分裂増幅、および減数分裂の分化を含む。また、減数分裂後の生殖細胞は、劇的な形態学的再成形プロセスだけでなく、生殖クロマチンヒストン·ツー·プロタミンスイッチのグ​​ローバルなエピジェネティックな再構成を受ける。 変異誘発または他の遺伝的ツールを使用して、減数分裂後の精子形成におけるタンパク質の役割を研究することは、多くの場合、調査中で本質的な胚、前減数分裂、またはタンパク質の減数分裂の機能によって妨害されている。このようなタンパク質の変異体の減数分裂後の表現型は、以前の発達ブロックを介して目立たなくすることができ、または表現型の解釈が複雑になることができた。モデル生物ショウジョウバエは、この問題へのバイパスを提供しています：無傷の精巣をし、初期の蛹から解剖生殖細胞のさえ嚢胞は培養液中にex vivoで開発することができます。そのような培養の使用を作ることは精巣で生殖細胞を生きたと生殖系列嚢胞の顕微鏡イメージングを可能にします。重要なことは、栽培精巣および生殖細胞は、それによって減数分裂後の段階を含む、精子形成の際に酵素機能の操作を可能にする、薬理学的阻害剤にアクセス可能になる。 提示されたプロトコルは、解剖や蛹精巣および生殖系列嚢胞を育成する方法について説明します。蛹精巣および培養条件の開発に関する情報は、培養中の生きた精巣および生殖系列シストの顕微鏡用撮像データと一緒に提供される。また、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤アナカルド酸を用いて、ヒストンからプロタミンスイッチをターゲットアッセイにより例示減数分裂後の精子形成を研究するための薬理学的なアッセイを説明します。原則として、この培養法は、多くのOに対処するために適合させることができる前後の減数分裂精子形成におけるTHER研究課題。

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Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

解剖、イメージング、および薬理学的治療： ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

17.3K ビュー.  Philipps-Universität Marburg. This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

ビデオ: Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

生物学

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

ショウジョウバエ幼虫NMJの解剖

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内</em開発の>イメージングショウジョウバエ</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

の解剖と染色ショウジョウバエ幼虫卵巣

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

初代ヒト卵管上皮細胞のex vivoでの文化

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

ショウジョウバエの蛹の腹部の免疫組織化学

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

の蛹ケースを画像化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

ex vivoで培養マウス胚の皮膚およびメラノブラストの移行のライブイメージング

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

マウス精巣の生体内マイクロインジェクションやエレクトロポレーションで

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

解剖、イメージング、および薬理学的治療： ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養

解剖、イメージング、および薬理学的治療：ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養