この方法は、コーヒーベリーボーラーに対する殺虫剤の毒性をテストするために、グリーンコーヒー果実を使用する。殺虫剤の施用は、昆虫の蔓延の前または後に行われ、昆虫の死亡率忌避性および他の効果を研究する。昆虫の成長に十分な栄養素を含む本物のグリーンコーヒーを使用することは、シミュレートされた自然条件下で昆虫に対する化合物の毒性を評価する最も適切な方法です。
このプロトコルは、化学殺虫剤の毒性効果の評価および真菌または忌避物質などの病原体に対する毒性効果の評価を可能にする。果物や昆虫のこの感染は、不適切な消毒が汚染による昆虫の死を引き起こす可能性があるため、重要なステップです。弱い昆虫は有毒な製品の結果を過大評価するため、昆虫の品質も重要です。
視覚的デモンストレーションは、昆虫の侵入プロセス、有毒物質を広げる適切な瞬間の果実の適切な段階の同定を可能にする。そして果実を解剖する方法。手順を実演するのは、研究室の研究助手であるクラウディア・マルティネスです。
まず、コーヒー農園から開花してから120〜150日後のおおよその発生年齢で早朝にグリーンコーヒーフルーツを収集します。約300個の均一な大きさで健康的な果物を選択し、茎を撤回します。グリーンコーヒーの果実を2%の石鹸溶液に浸し、こすって徹底的にきれいにします。
その後、きれいな水で果物を3回すすいでください。0.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸し、毎分110回転でシェーカーに10分間置きます。きれいな水で果物を3回すすぎ、滅菌ペーパータオルで乾かします。
UV対応の水平層流ステーション内に、UV源から55センチメートルの場所に15分間置いて、果物を照射します。5分ごとに果物を動かして、果物全体の適切な照射を確実にします。バイオアッセイを設定するには、同じ日に出現したコーヒーベリーボーラーを0.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸し、ブラシで10分間ゆっくりと攪拌します。
これらの昆虫をモスリン布でろ過し、滅菌蒸留水で3回洗う。滅菌ペーパータオルで余分な水分を取り除きます。実験ユニットごとに30個のグリーンコーヒーフルーツのグループを準備し、プラスチック製の箱に入れます。
ポータブル噴霧器ユニットを使用して評価のために異なる濃度の試験製品を適用し、ここでは、5%および6%のアルカロイドエマルジョンを使用した。対照として、グリーンコーヒー果実のグループに水を噴霧する。1回につき少なくとも3つの実験ユニットを利用し、次々と噴霧する。
滅菌フードで、グリーンコーヒーフルーツごとに2つのコーヒーベリーボーラー大人を放出し、30分後に箱を覆います。蔓延したグリーンコーヒーの果実が入ったプラスチック製の箱を、制御された状態で部屋やインキュベーター内の暗闇の中に放置してください。1日後、7日後、15日後、および21日後に、各箱の中の果物の外側のボーラーフルーツと生きている昆虫と死んだ昆虫の数を数えます。
侵入後20日目に、各グリーンコーヒー果実を倍率10倍の実体顕微鏡下で解剖し、健康な種子または各果実の昆虫によって損傷を受けた種子の数を数える。さまざまなコーヒーベリーボーラーの生物学的段階を数えます。各種子の死虫数を観察し、実験単位ごとの昆虫死亡率を決定する。
滅菌フード内で、コーヒーベリーボーラーの成虫を以前に消毒したグリーンコーヒーフルーツに2対1の比率で放出し、摂氏21度で3時間侵入を進行させる。ほとんどのグリーンコーヒーフルーツは、コーヒーベリーボーラーの腹部がまだ露出したまま3時間後に蔓延する必要があります。46個の寄生した果物を選択し、96ウェルのプラスチックラックに入れて、果物を穿孔するコーヒーベリーボーラーに直接スプレーできるようにします。
治療のために少なくとも3つのラックを少なくとも3回、順番にスプレーし、30分後にラックを覆います。20日後、10倍の倍率で実体顕微鏡下でグリーンコーヒー果実を解剖し、健康な種子または各果実の昆虫によって損傷を受けた種子の数を数える。異なるコーヒーベリーボーラーの生物学的段階と各種子の死虫数を数えて、実験単位ごとの昆虫死亡率を決定します。
果物に保護効果のある製品を評価するための最初の手順に従い、グリーンコーヒーフルーツの大人をプラスチック製の箱に放出します。次に、箱から飛び去るコーヒーベリーボーラーの数と、グリーンコーヒーフルーツに寄生する数を数えます。インキュベーション後、制御された条件下で、続いて、侵入後20日目に解剖し、種子および死んだ昆虫を数え、コーヒーベリーボーラーの侵入後に、製品を評価するために概説したステップに従う。
グリーンコーヒーの果実から出た、または果実から飛び去ったコーヒーベリーの穴の数を数えます。各処理物を噴霧した後、次いで、制御された条件下でのインキュベーションからのステップに従って、実験単位当たりの昆虫死亡率を決定した。5%および6%の殺虫剤をコーヒーベリーボーラーに施用し、20日目に高い虫死率を引き起こし、対照と比較して有意差を示した。
殺虫剤2種の施用は健康な種子の94%をもたらし、殺虫剤1種の健康な種子の89%をもたらしたことが分かった。種子の37%は対照群に寄生しなかった。侵入後の場合、製品は昆虫キューティクルに浸透し、昆虫の死亡率を引き起こした。
最も高い死亡率は殺虫剤2で起こった。殺虫剤の効果は、評価の20日目に、健康な非感染種子の割合に反映された。コーヒー種子の内部には、対照群で見つかった昆虫集団と比較して、水を噴霧した昆虫集団が減少した。
昆虫病原体と忌避剤の併用作用は、種子の損傷を最小限に抑え、昆虫の死亡率を最大にした。果物のこの感染と昆虫の消毒は、プロトコルの成功を保証します。この方法論はまた、コーヒーベリーボーラーに対するコーヒー果実の耐性または耐性を評価するためにも使用することができる。
昆虫耐性コーヒー種子の場合、昆虫集団に対しても悪影響が観察され得る。この方法論は、異なる作用機序を有する殺虫剤を評価するための昆虫学だけでなく、耐性品種の評価のための植物育種および果実/病原体相互作用を研究するための植物病理学においても使用することができる。
