שיטה זו משתמשת בפירות קפה ירוקים כדי לבחון את הרעילות של קוטלי חרקים נגד בור פירות יער הקפה. היישום של קוטל החרקים מבוצע לפני או אחרי התפשטות החרקים כדי לחקור את דחיית תמותת החרקים והשפעות אחרות. שימוש בקפה ירוק אמיתי עם חומרים מזינים המתאימים לצמיחת חרקים הוא הדרך המתאימה ביותר להעריך את הרעילות של תרכובות לחרקים בתנאים טבעיים מדומים.
הפרוטוקול מאפשר להעריך את ההשפעות הרעילות של קוטלי חרקים כימיים ולקראת פתוגנים כגון פטריות או חומרים דוחים. זיהום זה של הפירות והחרקים הוא השלב הקריטי שכן חיטוי לא תקין עלול לגרום למוות של חרקים עקב זיהום. איכות החרקים חשובה גם מכיוון שחרקים חלשים יעריכו יתר על המידה את התוצאות של מוצר רעיל.
הדגמה חזותית מאפשרת זיהוי של השלב המתאים של פירות תהליך התפשטות החרקים, הרגע המתאים להפצת החומר הרעיל. והדרך לנתח את הפירות. מדגימה את ההליך תהיה קלאודיה מרטינז, עוזרת מחקר מהמעבדה.
כדי להתחיל, לאסוף את פירות הקפה הירוק מוקדם בבוקר עם הגיל ההתפתחותי המשוער של 120 עד 150 ימים לאחר הפריחה ממטעי קפה. בחרו כ-300 פירות בגודל אחיד ובריא ומשכו את הפדונקלים. טובלים את פירות הקפה הירוק בתמיסת סבון של 2% ומנקים היטב על ידי שפשוף שלהם.
לאחר מכן לשטוף את הפירות שלוש פעמים עם מים נקיים. טובלים אותם בתמיסת 0.5% נתרן היפוכלוריט ומניחים אותם על השייקר למשך 10 דקות ב-110 סיבובים לדקה. יש לשטוף את הפירות במים נקיים שלוש פעמים ולייבש אותם במגבות נייר סטריליות.
הקרינו את הפירות על ידי הצבתם במרחק של 55 סנטימטרים ממקור ה-UV למשך 15 דקות, בתוך תחנת זרימה למינרית אופקית התומכת ב-UV. הזז את הפירות לאחר כל חמש דקות כדי להבטיח הקרנה נכונה של כל הפרי. כדי להכין את הבדיקות הביולוגיות, טבלו את הבורות של פירות יער הקפה שצצו באותו יום בתמיסת 0.5% נתרן היפוכלוריט והתסיסו אותם באיטיות עם מברשת במשך 10 דקות.
מסננים את החרקים האלה דרך מטלית מוסלין ושוטפים אותם שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים. מוציאים עודפי מים עם מגבות נייר סטריליות. מכינים קבוצה של 30 פירות קפה ירוק ליחידת ניסוי ומניחים אותם בקופסת פלסטיק.
יש ליישם ריכוזים שונים של מוצר בדיקה להערכה באמצעות יחידת מרסס ניידת, כאן נעשה שימוש בתחליבי אלקלואידים של 5% ו-6%. כבקרה, יש לרסס קבוצה של פירות קפה ירוקים במים. השתמשו בלפחות שלוש יחידות ניסוי בכל טיפול, תוך ריסוס בזו אחר זו.
במכסה המנוע הסטרילי, שחררו שני בוגרים משעממים של פירות יער קפה לכל פרי קפה ירוק, וכסו את הקופסאות לאחר 30 דקות. השאירו את קופסאות הפלסטיק עם פירות הקפה הירוקים שורצים בחושך בתוך חדר או אינקובטור, לאחר תנאים מבוקרים. לאחר 1, 7, 15 ו-21 ימים, ספרו את מספר פירות הבור וחרקים חיים ומתים מחוץ לפירות בכל קופסה.
לאחר 20 יום לאחר ההדבקה, נתחו כל פרי קפה ירוק תחת מיקרוסקופ סטריאו עם הגדלה של פי 10 וספרו את מספר הזרעים או הזרעים הבריאים שניזוקו על ידי החרקים בכל פרי. ספרו את השלבים הביולוגיים השונים של ברי הקפה. שימו לב למספר החרקים המתים בכל זרע כדי לקבוע את תמותת החרקים ליחידת ניסוי.
במכסה המנוע הסטרילי, שחררו את הבוגרים הבורים של פירות הקפה הירוקים שחוטאו בעבר ביחס של שניים לאחד ואפשרו להתפשטות להמשיך במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס. רוב פירות הקפה הירוקים צריכים להיות שורצי לאחר שלוש שעות עם הבטן של בור פירות יער הקפה עדיין חשופה. בחרו 46 פירות שורצים והניחו אותם במדף פלסטיק של 96 בארות, כך שניתן יהיה לרסס את הטיפול ישירות על בור פירות יער הקפה המנקב את הפרי.
מרססים שלושה מתלים לפחות שלוש פעמים לטיפול, אחד אחרי השני ומכסים את המדפים לאחר 30 דקות. לאחר 20 יום, נתחו את פירות הקפה הירוקים תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של פי 10 וספרו את מספר הזרעים או הזרעים הבריאים שניזוקו על ידי החרקים בכל פרי. ספרו את השלבים הביולוגיים השונים של בור פירות היער ואת מספר החרקים המתים בכל זרע כדי לקבוע את תמותת החרקים ליחידת ניסוי.
בצע את השלבים הראשונים להערכת מוצר עם השפעה מגנה על הפירות ושחרר את פירות הקפה הירוקים למבוגרים לתוך קופסאות הפלסטיק. לאחר מכן ספרו את מספר הבורות של פירות יער הקפה שעפים מהקופסאות ואת המספר השורץ את פירות הקפה הירוקים. לאחר הדגירה, בתנאים מבוקרים, ולאחר מכן כריתה ב 20 יום לאחר ההדבקה וספירת הזרעים והחרקים המתים, בצע את השלבים המתוארים להערכת המוצר, לאחר התפשטות בור פירות יער הקפה.
ספרו את מספר נשאות פירות הקפה שיצאו מפירות הקפה הירוקים, או עפו מהפירות. לאחר ריסוס כל טיפול, בצע את השלבים מדגירה בתנאים מבוקרים כדי לקבוע את תמותת החרקים ליחידת ניסוי. 5% ו-6% קוטלי חרקים שהוחלו על בור פירות יער הקפה, גרמו לתמותת חרקים גבוהה ביום ה-20, והראו הבדלים משמעותיים בהשוואה לבקרה.
נראה כי היישום של קוטל חרקים שני הביא ל-94% מהזרעים הבריאים, וקוטלי חרקים אחד הביא ל-89% מהזרעים הבריאים. 37% מהזרעים לא היו שורצים בקבוצת הביקורת. במקרה של התפשטות שלאחר ההדבקה, המוצרים חדרו לציפורן החרקים וגרמו לתמותת חרקים.
התמותה הגבוהה ביותר התרחשה עם קוטל חרקים שני. ההשפעות של קוטלי החרקים השתקפו באחוז הזרעים הבריאים שאינם נגועים, ביום ה-20 להערכה. אוכלוסיית חרקים מופחתת נמצאה בתוך זרעי הקפה בהשוואה לאוכלוסיית החרקים שנמצאה בקבוצת הביקורת, מרוססת במים.
פעולה משולבת של אנטומופתוגן ודוחה הביאה לנזק מינימלי לזרעים ולמקסימום תמותת חרקים. זיהום זה של הפירות וחיטוי החרקים מבטיחים את הצלחת הפרוטוקול. מתודולוגיה זו יכולה לשמש גם להערכת סובלנות או עמידות של פירות קפה לבור פירות יער הקפה.
ניתן לראות השפעה שלילית גם על אוכלוסיית החרקים במקרה של זרעי קפה עמידים בפני חרקים. מתודולוגיה זו יכולה לשמש לא רק באנטומולוגיה להערכת קוטל חרקים עם דרכי פעולה שונות, אלא גם בגידול צמחים להערכת זנים סובלניים ופתולוגיה של צמחים כדי לחקור את האינטראקציה בין פירות לפתוגנים.
