我々は、ヒト臍帯組織から間葉系幹細胞を単離するための我々のプロトコルと、それらを骨格筋系統に分化させるための堅牢な方法を説明する。この技術により、内皮由来の細胞の汚染をほとんどまたはまったく伴わずに、高い生存率と熱を有する間葉系幹細胞を単離し、これらの疾患において筋原性分化を効率的に誘導することができる。コードねじれと粘液の一貫性は、コードの取り扱いを困難にします。
我々は、コードを処理する方法、ウォートンのゼリーをこすり落とさないようにする方法、および集団から内皮細胞を排除する方法を示す。送達時に臍帯組織を採取した後、臍帯組織片を採取管から10平方センチメートルの組織培養処理皿に移し、新鮮なPBSで組織を十分に洗浄した。コードねじれと粘液質の表面をケアするには、片手に持った一対の鉗子で組織を固定します。
メスを使用して、縦方向のアクセスに沿ってコード組織を垂直にスライスし、2つの半分の円筒形の部分を得る。この時点で、臍帯動脈と静脈を観察します。メスを使用して、血管を表面から一方向に削り取って取り除き、PBSで臍帯組織をすすぎ、組織に関連するすべての残留血液を除去する。
コード組織の各半分を0.5立方センチメートルサイズの断片にミンチする。管腔表面が下を向いた状態で断片を皿の上に置き、皿を10分間短時間インキュベートする。インキュベーションの最後に、MEM Alpha修飾を含む20ミリリットルの培地を、コード組織を含むディッシュの側面に沿って穏やかに添加する。
外植体がその向きから外れていないことを確認し、インキュベーション中に外植体が吸収する組織の割合を説明するために余分な培地を追加します。その後、皿をインキュベーターに3日間置きます。インキュベーションの終了後、新鮮な培地を培養物に加え、皿を取り扱う際に培養物が衝撃や外植体の動きから保護されていることを確認します。
1週間後、滅菌鉗子を使用して、組織断片を個別に取り除き、適切なバイオハザードバッグを使用して廃棄します。既存の培地を保持し、10ミリリットルの新鮮な増殖培地を加える。個々のコロニーが70%のコンフルエントに達するまで4日ごとに増殖培地を交換し、原稿に記載されているように細胞を染色した後、フローサイトメトリーにより標識細胞を分析し、CD105 CD90陽性、およびCD105 CD73陽性細胞の割合を決定する。
CD105陽性細胞とCD34 CD45陰性細胞を別々に分析する。PBS中の0.01%コラーゲンおよび1ミリリットル当たり20マイクログラムのラミニンで組織培養プレートをコーティングし、室温で最低4時間ロッカーの上に置く。インキュベーション後、コラーゲンを除去し、PBSでプレートを洗浄し、次いで、増殖培地中の1平方センチメートル当たり10,000細胞密度でuMSCsをプレートする。
細胞が70%のコンフルエントに達したら、増殖培地を吸引し、培養プレートをPBSで2回すすいでください。筋原性進行の動態を決定するには、培養物に1日おきにM1培地を添加し、uMSCsのpax7、MyoD、ミオゲニン、およびミオシン重鎖の発現をそれぞれ2日、4~5日、6~7日、および10~14日で分析します。uMSCはCD105およびCD90の発現を表示し、造血マーカーCD34およびCD45を発現しない。
uMSCsはまた、uMSCsマーカーCD73の発現に対して陽性であり、uMSCsが複数のキーマーカーを発現していることを示している。uMSCsは、M1添加の最初の2日以内にpax7の発現を示し、続いてM1添加の最初の4日以内にMyoD発現を示した。細胞は、分化の6日目にミオゲニンタンパク質を発現し、続いて分化誘導の10日目から14日目の間にミオシン重鎖を発現する。
970の遺伝子が、未分化のuMSCと比較して筋原性分化の誘導に応答してアップレギュレートされた。より多くの筋原性遺伝子が、臍帯血由来uMSCと比較して、臍帯組織由来uMSCにおいてアップレギュレートされた。臍帯組織および臍帯血の両方が、アクチン結合およびサルコメア集合に関連する細胞骨格タンパク質に関連する遺伝子、収縮機能に関連するトランスポーター、筋肉量維持、カルシウムシグナル伝達、および酵素機能のアップレギュレーションを示した。
無菌条件下で組織を収集し、滅菌培養を維持する。コードは70%エタノールで外部から掃引し、できるだけ早く処理する必要があります。多くの再生療法は、継代の初期から多数の細胞を必要とする。
また、乾燥環境全体を模倣し、出生後の代謝を反映するためのモデルとして使用することもできます。
