우리는 인간 탯줄 조직에서 중간엽 줄기 세포를 분리하는 우리의 프로토콜과 골격근 혈통으로 분화시키는 강력한 방법을 설명합니다. 이 기술을 통해 우리는 내피 기원의 세포의 오염이 거의 없거나 전혀없는 높은 생존력과 열을 가진 중간엽 줄기 세포를 분리하고 이러한 질병에서 효율적으로 근형성 분화를 유도 할 수 있습니다. 코드 비틀림과 점액 일관성으로 인해 코드를 다루기가 어렵습니다.
우리는 코드를 처리하고, 와튼의 젤리를 긁지 않고, 내피 세포를 개체군에서 배제하는 방법을 보여줍니다. 전달 시간에 탯줄 조직을 수집한 후, 수집 튜브로부터 탯줄 조직 조각을 10 평방 센티미터 조직 배양 처리 접시로 옮기고, 신선한 PBS로 조직을 철저히 세척한다. 코드 비틀림과 점액 표면을 관리하려면 한 손에 한 쌍의 포셉으로 조직을 고정하십시오.
메스를 사용하여 탯줄 조직을 세로 접근을 따라 수직으로 슬라이스하여 두 개의 반 원통형 조각을 얻습니다. 이 시점에서 탯줄 동맥과 정맥을 관찰하십시오. 메스를 사용하여, 표면으로부터 일방향으로 이들을 긁어내어 혈관을 제거하고 PBS로 탯줄 조직을 헹구어 조직과 관련된 잔류 혈액을 모두 제거하였다.
탯줄 조직의 각 절반을 0.5 입방 센티미터 크기의 조각으로 다듬는다. 발광 표면이 아래를 향하게하는 파편을 접시에 놓고 접시를 10 분 동안 잠깐 배양하십시오. 인큐베이션이 끝날 때, MEM 알파 변형을 함유하는 배지 20 밀리리터를 탯줄 조직을 함유하는 접시의 측면을 따라 부드럽게 첨가한다.
외식편이 그들의 배향에서 벗어나지 않도록하고 조직 외식편이 배양 중에 흡수 될 분율을 설명하기 위해 과도한 배지를 추가하십시오. 그런 다음 접시를 사흘 동안 인큐베이터에 놓습니다. 배양이 끝나면 배양물에 신선한 배지를 첨가하고 접시를 취급하는 동안 배양물이 외식재의 충격과 움직임으로부터 보호되도록하십시오.
일주일 후, 멸균 포셉을 사용하여 조직 파편을 개별적으로 제거하고 폐기를 위해 적절한 생물학적 위험 백을 사용하여 폐기하십시오. 기존 배지를 유지하고 10 밀리리터의 신선한 성장 배지를 첨가하십시오. 개별 콜로니가 70%의 합류점에 도달할 때까지 나흘마다 성장 배지를 교체하고, 원고에 기재된 바와 같이 세포를 염색한 후, 표지된 세포를 유세포 분석기로 분석하고, CD105 CD90 양성 및 CD105 CD73 양성 세포의 백분율을 결정한다.
CD105 양성 및 CD34 CD45 음성 세포를 별도로 분석한다. 조직 배양 플레이트를 PBS 중 밀리리터 당 0.01% 콜라겐 및 20 마이크로그램의 라미닌으로 코팅하고 실온에서 최소 네 시간 동안 로커 상에 놓는다. 인큐베이션 후, 콜라겐을 제거하고 플레이트를 PBS로 세척한 다음, 성장 배지에서 평방 센티미터 밀도 당 10, 000 세포 밀도에서 uMSCs를 플레이트화하였다.
일단 세포가 70% 컨플루언시를 달성하면, 성장 배지를 흡인하고, 배양 플레이트를 PBS로 두 번 헹구었다. 근인성 진행의 동역학을 결정하기 위해, 배양물에 격일로 M1 배지를 첨가하고, 각각 이틀, 사흘 내지 5일, 육 내지 7일, 및 10 내지 10일 내지 10일에 pax7, MyoD, 미오게닌 및 미오신 중쇄의 발현에 대한 uMSCs를 분석한다. uMSCs는 CD105 및 CD90의 발현을 표시하고, 조혈 마커 CD34 및 CD45를 발현하지 않는다.
uMSCs는 또한 uMSCs 마커 CD73의 발현에 대해 양성이었고, 이는 uMSCs가 다수의 키 마커를 발현한다는 것을 나타낸다. uMSCs는 M1의 첨가 후 처음 이틀 이내에 pax7의 발현을 나타냈고, 이어서 M1 첨가의 처음 나흘 이내에 MyoD 발현이 나타났다. 세포는 분화 6일에 미오게닌 단백질을 발현하고, 이어서 분화 유도 후 10일에서 14일 사이에 미오신 중쇄를 발현한다.
970개의 유전자는 미분화된 uMSCs와 비교하여 근인성 분화의 유도에 반응하여 상향조절되었다. 더 많은 근인성 유전자는 제대혈 유래 uMSCs에 비해 제대혈 유래 uMSCs에서 상향조절되었다. 제대혈 조직과 제대혈 모두 액틴 결합 및 사르코머 조립과 관련된 세포골격 단백질, 수축 기능과 관련된 수송체, 근육량 유지, 칼슘 신호 전달 및 효소 기능과 관련된 유전자의 상향 조절을 보였다.
조직을 무균 조건 하에서 수집하고 멸균 배양을 유지하십시오. 코드는 외부에서 70 % 에탄올로 스윕하고 가능한 한 빨리 처리해야합니다. 많은 재생 요법은 초기 계대에서 많은 수의 세포를 필요로합니다.
또한 전체 건조 환경을 모방하고 산후 신진 대사를 반영하는 모델로 사용할 수 있습니다.
