サンゴのマイクロプロパゲーションはまだ初期段階にあります。ポリープ救済のためのプロトコルを最適化することは、科学者が実験室環境でサンゴを研究するためのモデルとしてポリープを使用できるようにするために、このギャップを埋めるための鍵です。ポリープ救済は、小さなサンゴの破片から複数の伝播を作成することを可能にします。
ポリープは、例えば、サンゴの微視的なプロセスの観察を容易にするさまざまな実験に使用することができます。サンゴ礁が脅かされています。私たちの目標は、この複製可能なモデルを使用して、サンゴを白化やその他の環境上の脅威から効率的かつ非侵襲的な方法で保護するための戦略を開発することです。
この方法は、サンゴの生理学、宿主のマイクロバイオーム相互作用、および漂白に関与するメカニズムの調査に役立つ可能性があります。このような知見は、例えば、サンゴプロバイオティクスの最適化に貢献することができる。適切な塩分濃度の海水を使用することが鍵です。
塩分濃度はサンゴの自然環境のレベルから始まり、ストレスが過度に有害でないようにゆっくりと増加しなければなりません。正しい瞬間にポリープを収集し、最も無傷のポリープを選択することは、彼らの生存にとって非常に重要です。視覚的なデモンストレーションは、これらの手がかりを理解するために不可欠です。
まず、斜めの切断ペンチを使用してサンゴのコロニーから小さな破片を切断し、サンゴのコロニーが順応した12ミリリットルの海水で満たされた小さなペトリ皿に入れます。プレートを周囲温度で約24時間開いたままにして、水が蒸発し、塩分濃度が徐々に増加するようにします。ポリープ間で組織の消化が観察可能な場合は、1ミリリットルの移送ピペットを使用して、サンゴ組織に近い穏やかな流れを作り出します。
この流れは、骨格から周囲の組織をすでに消化したポリープの剥離をゆっくりと完了させ、ピペットでペトリ皿の水を等沸点水でゆっくりと交換します。塩分濃度の高い海水を調製するには、通常の海水を取り、海水に塩化ナトリウムを加えて塩分濃度が85%上昇するまで3リットルの高塩分濃度海水を調製する 前述のようにサンゴの小さな断片を切断した後、蠕動ポンプに接続された3リットルの等沸性海水を入れた10リットルの容器に入れます。この容器に、予め用意した塩分濃度の高い海水3リットルを1時間126ミリリットルの割合で24時間充填し、塩分濃度を約40%上昇させるピペットを用いて、ポリープを骨格から放出する穏やかな水の流れを作ります。
容器内の水を等沸性の海水とゆっくりと交換します。脱イオン水1リットルに塩化ナトリウム26.29グラム、塩化カリウム0.872グラム、硫酸マグネシウム2.16グラム、塩化マグネシウム11.94グラム、硫酸ナトリウム3.42グラム、炭酸水素ナトリウム0.26グラムを加えてカルシウムフリー海水を調製し、このカルシウムフリー海水でシャーレを満たします。小さなサンゴの破片を切った後、ペトリ皿のカルシウムを含まない海水に浸します。
皿を回転数80rpmの回転数で3時間オービタルインキュベーターに入れ、その後、40実用的な塩分単位の人工海水で調製され、アンピシリン1リットルあたり100ミリグラムを含む20%DMEMで満たされたペトリ皿に断片を移す。断片を摂氏26度および80rpmでインキュベートする。ポリープと個々のポリープの間で組織消化が観察可能になるまで毎日培地を交換し、その後、ポリープを滅菌海水に移し、1時間インキュベートする。
ポリープが非ストレス性塩分濃度でろ過された海水に戻されたら、実体顕微鏡下で毛様体の流れによって引き起こされる組織の完全性と動きを観察して、生存可能なポリープを選択します。選択したポリープをシャーレに入れ、ポリープがディッシュから浮かび上がらないように、200マイクロメートルメッシュサイズのプランクトンネットでペトリ皿を覆います。使用するサンゴ種に適した条件で水槽の中にペトリ皿を置きます。
藻類の過増殖を防ぐために、少なくとも週に1回はペトリ皿を開けて水を新しくし、皿をきれいにしてください。前述のようにポリープを選択した後、トランスファーピペットを用いて、50ミリリットルの等沸性海水で満たされた75平方センチメートルの表面セルフラスコに入れ、フラスコを閉じ、12時間の光サイクル、摂氏26度および40rpmに設定したインキュベーターに入れる。フラスコが藻類またはバイオフィルムで満たされた場合は、内容物を清潔なフラスコに移します。
この研究では、ポリープ救済は3つの異なる方法によって誘導された。水分蒸発法は、インキュベーションの24時間以内に完全な救済をもたらし、塩分濃度は24時間後に40から59の実用的な塩分単位に増加した。塩水供給法はまた、24時間のインキュベーション後にポリープ救済をもたらした。
ここで、塩分濃度は、12時間のインキュベーション後に40から52の実用的な塩分濃度単位に増加し、24時間後に59の実用的な塩分濃度単位に増加した。カルシウムを含まない海水中でのインキュベーションによる救済誘導は、その中のポリープの3時間のインキュベーション、続いて20%DMEM培地での20時間のインキュベーションの後に完了し、3つの方法すべてにおいて、個別化されたサンゴポリープを生成することができた。蒸発法で発生したサンゴポリープは6週間生存できるのに対し、塩分濃度の高い海水供給法で発生したサンゴポリープは水槽内のシャーレで8週間生存できます。
インキュベーター内の細胞培養フラスコに保管された海水蒸発法から得られたポリープは、組織の完全な解離なしに最大3週間生存した。ポリープを骨格から切り離すときは、優しくすることが重要です。完全に剥離していない場合、水を強くピペッティングして強制的に剥離させると、損傷を引き起こし、生存率が低下します。
これらの方法を用いて、ポリープの沈降を誘導することができる。ポリープの決済は、その石灰化と成長プロセスに関する質問に答えることができます。ポリープ救済誘導の開発後、研究者はサンゴ骨格の初期形成を研究し、ポリープスケールのサンゴの白化を直接視覚化することができました。
