La micropropagazione del corallo è ancora agli inizi. L'ottimizzazione dei protocolli per il salvataggio dei polipi è la chiave per colmare questa lacuna consentendo agli scienziati di utilizzare i polipi come modelli per studiare i coralli in ambienti di laboratorio. Il salvataggio di Polipi consente di creare più propagazioni da piccoli frammenti di corallo.
I polipi possono essere utilizzati in diversi esperimenti facilitando l'osservazione di processi microscopici nei coralli, per esempio. Le barriere coralline sono minacciate. Il nostro obiettivo è quello di utilizzare questo modello replicabile per sviluppare strategie per proteggere i coralli dallo sbiancamento e da altre minacce ambientali in modo efficiente e non invasivo.
Questo metodo potrebbe aiutare lo studio della fisiologia del corallo, delle interazioni del microbioma ospite e dei meccanismi coinvolti nello sbiancamento. Tali risultati possono contribuire all'ottimizzazione dei probiotici di corallo, per esempio. L'uso di acqua di mare con un'adeguata salinità è fondamentale.
La salinità deve iniziare a livello dell'ambiente naturale del corallo e aumentare lentamente in modo che lo stress non sia eccessivamente dannoso. Raccogliere polipi al momento giusto e scegliere quelli più intatti è fondamentale per la loro sopravvivenza. Una dimostrazione visiva può essere vitale per comprendere questi segnali.
In primo luogo, utilizzare pinze da taglio diagonali per tagliare piccoli frammenti da una colonia di coralli, quindi metterli in piccole piastre di Petri riempite con 12 millilitri di acqua di mare a cui la colonia di coralli è stata acclimatata. Lasciare la piastra aperta per circa 24 ore a temperatura ambiente in modo che l'acqua evapori e la sua salinità aumenti gradualmente. Quando la digestione dei tessuti è osservabile tra i polipi, utilizzare una pipetta di trasferimento da 1 millilitro per creare un flusso delicato vicino al tessuto corallino.
Il flusso aiuterà lentamente a completare il distacco dei polipi che hanno già digerito il tessuto intorno a loro dallo scheletro, quindi con la pipetta, scambierà lentamente l'acqua nella capsula di Petri con acqua isosmotica. Per preparare acqua di mare ad alta salinità, prendere la normale acqua di mare e aggiungere cloruro di sodio all'acqua di mare per preparare tre litri di acqua di mare ad alta salinità fino a quando la salinità aumenta dell'85% Dopo aver tagliato piccoli frammenti di corallo come dimostrato in precedenza, metterli in un contenitore da 10 litri con tre litri di acqua di mare isosmotica collegata a una pompa peristaltica. Riempire questo contenitore con tre litri di acqua di mare ad alta salinità precedentemente preparata per 24 ore ad una velocità di 126 millilitri all'ora per aumentare la salinità di circa il 40% Utilizzando una pipetta, creare un flusso delicato di acqua per rilasciare i polipi dallo scheletro.
Scambia lentamente l'acqua nel contenitore con acqua di mare isosmotica. Aggiungere 26,29 grammi di cloruro di sodio, 0,872 grammi di cloruro di potassio, 2,16 grammi di solfato di magnesio, 11,94 grammi di cloruro di magnesio, 3,42 grammi di solfato di sodio e 0,26 grammi di bicarbonato di sodio a un litro di acqua di mare deionizzata per preparare acqua di mare priva di calcio, quindi riempire le piastre di Petri con questa acqua di mare priva di calcio. Dopo aver tagliato piccoli frammenti di corallo, immergerli in acqua di mare priva di calcio nelle piastre di Petri.
Mettere le piastre in un incubatore orbitale per tre ore ad una velocità di rotazione di 80 rpm, quindi trasferire i frammenti a piastre di Petri riempite con DMEM al 20% preparate con acqua di mare artificiale di 40 unità di salinità pratiche e contenenti 100 milligrammi per litro di ampicillina. Incubare i frammenti a 26 gradi Celsius e 80 rpm. Scambia il mezzo ogni giorno fino a quando la digestione dei tessuti è osservabile tra polipi e i singoli polipi iniziano a staccarsi dallo scheletro, quindi trasferisci i polipi in acqua di mare sterilizzata e incuba per un'ora.
Una volta che i polipi vengono restituiti all'acqua di mare filtrata con salinità non stressante, selezionare i polipi vitali osservando l'integrità del tessuto e il movimento causato dal flusso ciliare sotto uno stereomicroscopio. Posizionare i polipi selezionati in una capsula di Petri e coprire la capsula di Petri con una rete di plancton di 200 micrometri di dimensioni della rete in modo che i polipi non galleggino lontano dal piatto. Posizionare la capsula di Petri all'interno di un acquario con condizioni appropriate per le specie di corallo utilizzate.
Per prevenire la crescita eccessiva di alghe, aprire la capsula di Petri almeno una volta alla settimana per rinnovare l'acqua e pulire il piatto. Dopo aver selezionato i polipi come mostrato in precedenza, utilizzando una pipetta di trasferimento, posizionarli in un pallone a celle di superficie di 75 centimetri quadrati riempito con 50 millilitri di acqua di mare isosmotica, quindi chiudere il pallone e metterli in un incubatore impostato a cicli di luce di 12 ore, 26 gradi Celsius e 40 giri / min. Se il pallone viene riempito con alghe o biofilm, trasferire il contenuto in un pallone pulito.
In questo studio, il salvataggio del polipo è stato indotto da tre diversi metodi. Il metodo di evaporazione dell'acqua ha portato a un salvataggio completo entro 24 ore dall'incubazione e la salinità è aumentata da 40 a 59 unità di salinità pratiche dopo 24 ore. Il metodo di approvvigionamento di acqua salata ha anche portato al salvataggio del polipo dopo 24 ore di incubazione.
Qui, la salinità è aumentata da 40 a 52 unità di salinità pratica dopo 12 ore di incubazione, e poi a 59 unità di salinità pratiche dopo 24 ore. L'induzione del salvataggio attraverso l'incubazione in acqua di mare priva di calcio è stata completata dopo tre ore di incubazione di polipi in esso, seguita da 20 ore di incubazione nel mezzo DMEM al 20%, In tutti e tre i metodi, potrebbero essere generati polipi di corallo individualizzati. I polipi di corallo generati dal metodo di evaporazione potrebbero sopravvivere per sei settimane, mentre quelli prodotti dal metodo di approvvigionamento di acqua di mare ad alta salinità potrebbero sopravvivere per otto settimane in piastre di Petri all'interno di acquari.
I polipi ottenuti dal metodo di evaporazione dell'acqua di mare conservati in palloni di coltura cellulare all'interno di incubatori sono sopravvissuti fino a tre settimane senza la completa dissociazione dei loro tessuti. Quando si staccano i polipi dallo scheletro, è importante essere gentili. Se non sono completamente staccati, forzare il distacco con acqua fortemente pipettata causerà danni e tassi di sopravvivenza più bassi.
Usando questi metodi, l'insediamento di polipi può essere indotto. L'insediamento di polipi può rispondere a domande sui suoi processi di calcificazione e crescita. Dopo lo sviluppo dell'induzione del salvataggio dei polipi, i ricercatori sono stati in grado di studiare la formazione iniziale dello scheletro di corallo e visualizzare direttamente lo sbiancamento dei coralli nella scala dei polipi.
