Maldi MS分光イメージングは、過度のサンプル修飾なしに、脂質の存在量と分布を識別および視覚化するための確立された有用なツールです。Maldiイメージングの主な利点は、標識なしで脂質をその場で検出し、大量のサンプルを同時に分析できることです。習うより慣れろ。
実際の実験サンプルを処理する前に、よく練習してください。サンプル調製時間を最小限に抑え、手順全体の汚染を回避します。まず、気泡の形成を避けながら、最適な切断温度またはOCTをクライオモールドの深さの半分までプラスチッククライオモールドに追加します。
金型を平らな面に数分間置いてから、ドライアイスに移します。クライオモールドをドライアイス上で平らに保ち、OCTが平らで均一な表面を形成するようにします。OCTが金型内で完全に固まるまで待ちます。
冷凍OCTステージをすぐに使用するか、マイナス80°Cで保管してください。成虫のハエを麻酔した後 二酸化炭素を使用して、実験室用ワイプを含むペトリ皿を準備します。水を使用してワイプの一部を湿らせ、静電気を減らします。
ワイプを半分濡らし、半分乾いた状態に保ちます。解剖スコープ1の下でフライヘッドを切断した後、4〜5個のヘッドを収集し、実験室用ワイプの乾燥領域に置きます。OCTステージをドライアイスから顕微鏡2にしましょう。
すぐにヘッドをOCTステージに移し、OCTの溶融を防ぐために約30〜60秒かかるすばやく配置します。OCTからの適切なサポートを確保するために各ハエの脳の周りに約1ミリメートルの空白スペースを残し、セクションを処理するための十分なスペースを提供するためにブロックの端から4〜5ミリメートルの空白スペースを残します。OCTステージをドライアイスに戻し、約3分間そのままにして、OCTステージが凍って固いことを確認します。
すべてのフライヘッドが揃ったら、OCTステージをさらに5〜10分間ドライアイスの上に置きます。OCTステージをドライアイスから平らな面に移し、大量のOCT化合物をすばやく追加してすべてのサンプルを覆い、クライオモールド全体を充填します(約3秒かかります)。直ちにクライオモールドをドライアイスに戻し、埋め込まれた組織を含むOCTブロック全体を凍結します。
OCTステージをドライアイスの上にさらに5〜10分間置きます。クライオモルドのマージンにサンプルのラベルを付け、凍結したサンプルを摂氏マイナス80度で切片化する準備ができるまで保管します。抵抗に設定された電圧計を使用してITOスライドの導電率をテストして、ITOコード側を確認します。
抵抗測定のある側を、組織を接着する側としてマークします。ラベルを付け、スライドの汚染を防ぐために、常にスライドの下部に実験室用ワイプをセットしてください。次に、組織をクライオスタットチャンバー内で30〜45分間平衡化させます。
クライオスタットを、できれば70%エタノールで洗浄します。ロールプレートを段階的に拭き、使用済みのブレードを取り外します。追加のクリーンワイプを使用して、エタノールが蒸発し、切片化を開始する前にすべての表面が乾いていることを確認してください。
次に、組織の種類に応じてクライオスタットチャンバー砂試料ヘッドの温度を調整します。OCTを使用して試験片ホルダーに組織を取り付けます。 OCTブロックのベースを覆うのに十分なOCTを使用し、ブロックをできるだけ平らに取り付けるように注意してください。
ステージにきれいな刃を置き、ロックします。必要に応じて試験片のヘッドをステージに向けて配置し、目的の切断角度を実現します。次に、関心のある領域が見つかるまで、厚いセクションで切断を開始します。
ステージを清潔に保つために、事前に冷却されたアーティストブラシで余分な部分を常に払い落とします。必要に応じてチャンバー温度をわずかに調整し、目的の領域に到達したら、セクションの厚さを10〜12マイクロメートルに変更します。目的のセクションを慎重に収集します。
室温のITOスライドを取り、セクションの上に配置します。セクションにそっと近づき、クライオスタットステージに痕跡を残さずにスライドに接着します。スライドをラックに脇に置くか、複数のセクションのコレクションの間のクライオスタットの外側で実験室で拭きます。
同じコホートの異なるサンプル間で比較したい場合は、複数のサンプルのセクションを1つのスライドに配置して、同時に分析して変動を最小限に抑えます。Maldiターゲットホルダーは1回の実行で2つのスライドを収容できるため、必要に応じて2つのスライドに分けます。真空ボックス内のスライドを、最下層として乾燥物を備えた乾燥物に輸送します。
スライドを真空下で30〜60分間駆動し、マトリックス堆積に進みます。マトリックスとしてメタノール水中の2つの5つのジヒドロキシ安息香酸(DHB)を使用する。スライドをスライドトランスポーターに入れ、開口部をワックスフィルムでしっかりと密閉します。
ジップバッグで密封します。乾燥剤の入った別のジッパーバッグに入れます。外側にラベルを付け、適切なドライアイでサンプルをマルディコア施設に出荷します。
マトリックス堆積には、マトリックスとしてDHBとメタノール水1ミリリットルあたり40ミリグラムを使用し、自動HTX M5マトリックス噴霧器を使用してスプレーします。10PSIの窒素ガス圧力を使用してください。Maldiタイムオブフライト、MS機器、陽イオンモードを使用して、マススペクトルを取得します。
アセトニトロ中の0.5マイクロリットルの赤リンエマルジョンをITOスライドにスポットして、機器を校正します。スペクトルを使用して、二次検量線を適用することにより、100〜1000 MZの質量範囲で機器を校正します。レーザースポット径を40マイクロメートルのラスター幅の変調ビームプロファイルとして中程度に設定し、アレイ位置あたり1000ヘルツのレーザー繰り返し速度で500ショットを合計して画像データを収集します。
次に、スペクトルデータを記録します。二乗平均平方根正規化を使用して画像データ解析を実行し、プラスマイナス0.10ダルトンの帯域幅でイオン画像を生成します。ソフトウェアを使用して、同じ実験のOCTと脳組織の両方のスペクトルを調整し、OCTのイオン抑制干渉の重複するピークを評価します。
最後に、組織サンプルを含むMALDIスライドをヘマトキシリンとエオジン、またはHとE染色で処理します。Maldi MS分析からの画像は、LPR1ノックアウト変異脳における脂質含有量の一般的な減少を明らかにした。代表的なHおよびE染色された成体のハエ脳切片をここに示す。
脂質種、それぞれのMZ値、およびヒートマップのスケールもこの画像に示されています。少なくとも4つの生物学的反復からの対照と比較したLPR1ノックアウト変異体における減少の平均倍数を、矢印の横の数字として示す。対照および変異型ハエの両方から脳組織領域における選択されたブランクOCT領域のマススペクトルは、MZ1〜1000およびMZ520〜900の範囲で示されている。
OCTの干渉は、イオン抑制現象とオーバーラップ信号の問題の両方に関連しています。リピドミクスデータの忠実度を維持するには、適切なサンプル調製、解剖、およびクライオ切片作成が不可欠です。Maldi実験を実行した後、脂質の同一性は、液体クロマトグラフィー、質量分析ベースのリポドミクスとしても知られるLCMSによって検証できます。
この技術は、脳内のヒト疾患に関連する代謝変化を理解する道を開く強力なソフトモデルシステムを使用することにより、脳脂質の恒常性に関する分子的洞察を得ます。
