私たちは、アダム·コスターで親切なフィードバックや議論のためのAltschulerと呉ラボの他のすべてのメンバーに感謝。この研究は、米国国立衛生研究所によってサポートされていましたR01 GM085442とCA133253（SJA）、R01 GM081549（LFW）、CPRIT RP10900（LFW）、およびウェルチ財団、I-1619（SJA）とI-1644（LFW）を付与します。

1。準備サンプルとイメージング<ol><li>細胞培養<ol><li>日常の文化を分割し、20から70までパーセントコンフルエンスで維持する。実験前に、ある日、（材料の表を参照して、ダルベッコ改変イーグル培地）、DMEMでHeLa細胞を成長させ、10％FBS（ウシ胎児血清）および1×ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した。 </li><li>実験の日に、分割細胞は、培養（約50％コンフルエント）に成長している。 </li><li>数秒間トリプシン/ EDTA（エチレンジアミン四酢酸）の約2ミリリットルに公開、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で細胞を洗浄。過剰トリプシン/ EDTAを吸引し、約3分間RTでフード内トリプシン/ EDTAの薄膜を浴びた細胞を維持する。 </li><li>機械的に二度振盪フラスコ、血清添加培地で細胞を剥離。細胞を計数し、メディアの5000 cells/50μlに希釈し、すぐにうまく自動液体処理ロボット（唯一の30を使用して384ウェルガラスボトムプレートに50μL/ウェルプレートプレートのS）は、ここで使用されている。 </li><li>ウェル5内のエッジ効果を最小にするために室温で30分間プレートをインキュベートする。一晩37℃/ 5％CO 2インキュベーター中でRTインキュベーション、場所プレートた。 </li><li>各薬剤は、二重にアッセイする。プレートは、既にメディアを含む上の対応するウェルへの薬物の25を添加する。 </li><li> 24時間後の薬物治療におけるPBS中の4％パラホルムアルデヒド溶液でプレートを固定する。 </li></ol></li><li>染色 ここで使用された具体的な一次抗体、蛍光標識二次抗体および他の蛍光汚れ、材料の表に示します。 <ol><li>透過処理3分間TBS中の0.2％トリトンX-100溶液（トリス緩衝食塩水）で細胞を固定し、TBST（トリス緩衝食塩水+ Tween 20）で3回洗浄した。ブロッキングのためTBST中5％BSA（ウシ血清アルブミン）溶液を加える。 </li><li>室温で2時間プレートをインキュベートし、その後、TBSTで3回洗浄する。 </li><li>一次抗体dilutを作るTBST中の5％BSA中のイオン（材料の表を参照）、/ウェル10μlを加える。室温で2時間プレートをインキュベートした後、TBSTで3回洗う。 </li><li> TBST中二次抗体dilutionin 5％BSAを作る（材料の表を参照）、/ウェル10μlを加える。 </li><li>室温で2時間暗所に静置し、その後、TBSTで二回洗う。 </li><li> PBSに（材料の表を参照）ヘキストおよびファロイジンのための希釈液を調製し、同様に10μL/を追加します。 </li><li> RTで30分間、暗所でプレートをインキュベートする。 </li><li>後の2 TBST洗浄、4℃のCO / Nの箔とストア内のカバープレート</li></ol></li><li>イメージング 1x1のカメラのビニングで20X対物レンズを用いた落射蛍光顕微鏡を用いて画像を取得する。 480イメージ（X3チャンネル）の合計、各ウェルのための16の画像を取得。 </li></ol> 2。画像を分析するダウンロードしphenoripper.orgからPhenoRipperをインストールし、IMAの分析を開始しPhenoRipperを起動GES。 PhenoRipperは現在、TIFF、PNG、およびJPEGとMATLABでサポートされているすべての他のフォーマットを（顕微鏡のソフトウェアは、通常のTIFFにエクスポートをサポート）をサポートしています。 2.1データのロード<ol><li>標準的な名前付け/組織規則は、ローディングイメージと関連付けるメタデータにすることができる顕微鏡画像、存在しない（このような治療のタイプなどすなわち実験注釈を、よく数など）のワークフローの中で最も困難な部分。提示された方法（後述）のいずれかを選択します。 <ol><li> PhenoLoader：必要に応じてファイル名および/ ​​またはディレクトリ構造（ 例えば 、B16 HeLa_Drug5-DAPI.pngイメージがよく、B16からのものであることを示している可能性があり、グループのイメージに十分な情報が含まれている場合に、データをロードし、半自動的に、このオプションを選択し、細胞を処理し、この命名規則と、うまくA1または薬物5で処理されたからすべての画像を簡単にグループ化することができる） - IDが5であり、画像は、核のDAPI染色を捕獲薬剤と。ウィザードの意志画像群とメタデータを関連付けると、次のようにマーカーを定義するためのステップバイUserステップをガイド。 <ol><li> PhenoLoaderウィンドウにアクセスするには、「ファイル構造」をクリックします。 </li><li>画像データセットを含むディレクトリを選択して「ルートディレクトリを定義」をクリックします。次に、解析（オプション、空のままにすることができます）のために使用されていないファイル（使用されていないファイル）をフィルタリングします。 </li><li>実験に使用したバイオマーカーを指定し、画像とそれらを関連付けるための「マーカーの定義」をクリックします。具体的には、一意のバイオマーカーを特定し、ファイル名の一部を選択して、画像ファイルをクリックしてください。最後に、各バイオマーカーの名前を入力します。 </li><li>各画像に情報を関連付けるために「メタデータを定義する」をクリックします。具体的には、画像ファイルをクリックして[画像情報（よく名の例： &quot;B16&quot;）を特定し、ファイル名の一部を選択します。ウィンドウには、グループ名（ 例： &quot;を求め我LL &quot;）の名前を入力し、ポップアップ表示されます。ファイル名から抽出されたグループのメンバーが） 例えばよく名前の完全なリスト（グループテーブルに表示されます。ファイル名に存在しない付加的な情報を追加するには、をクリックして「 （オプション）次の「追加のグループ名（ 例：入力し「メタデータグループの追加」ボタンをクリックして「薬剤」）と、事前に定義されたグループの各値（ 例えば 「ウェル」）、その値を入力します（ 例：「タキソール」） 。加えることができる付加的なグループの数に制限はない。 </li><li>最後に、メタデータファイルを生成し、解析を継続して &quot;作成Metadatafile」をクリックしてください。メタデータファイルが以前に生成された場合、上記のステップは、直接オプション（下記3に記載されている）「メタファイル」を使用してファイルをロードすることによって回避することができる。 </li></ol></li><li>正規表現ベースのテンプレート：正規表現は、パターンにマッチするための標準的なアプローチであるテキスト内。ファイル名および/またはディレクトリ構造は、グループのイメージに十分な情報が含まれており、命名規則は、既存のテンプレートのいずれかと一致する場合に、このオプションを選択します。正規表現に基づいたカスタムテンプレートは、手動で定義され、再使用することができる。この高度なオプションは、正規表現に精通してユーザーにお勧めします。 </li><li>メタデータファイル：究極のカスタマイズ性のため、このオプションを選択します。定義し、カンマ区切り値、各画像に関連付けられたファイル名やメタデータを含む（CSV）ファイルをロードします。ファイル形式の例では、Webサイト（phenoripper.org）のダウンロード部分で提供されています。単純にそれに含まれる情報を表示するインタフェースを介してファイルをロードします。 </li></ol></li><li>冗長なサンプリングを避けるために、実験での反復を定義するメタデータフィールドを選択します。 IMPRでき（良くするなど ）、それらを一緒にグループ化し、複製物を（ウエル内などの全ての画像のようになります）が含まれているデータ·セットの場合オベパフォーマンス。ほとんどの場合、ランダムなサブセットを選択し、デフォルトのオプション「ランダム（知らない）」を選択することが合理的である。 </li></ol> 2.2解析パラメータの設定データセットを処理するのに必要なパラメータを定義する」に設定パラメータ」をクリックします。定義するパラメータは、左側のパネルにあります。右側のパネルには、データセットのマージされたサンプルが表示されます。異なる画像を切り替えるために、左/右の矢印をクリックしてください。 <ol><li>閾値強度：大体のイメージの細胞部分（というよりも、バックグラウンド、非細胞領域）を識別するために、適切なしきい値を選択します。閾値はPhenoRipperによって事前に計算されるが、画像の上に利用可能なスクロールバーを使用して、細胞領域の強調表示を改善するように調整されてもよい。選択された閾値は、すべての画像にまたがって機能しない場合は、むしろ細胞領域を落とすよりも非細胞領域を含むように、しきい値を下げる。 </li><li>ブロックSIZE：グリッドに画像をピクセル単位で適切なブロックサイズを選択してください。指定されたサイズのブロックが画像に重畳される。 20から30ブロック/セルの平均値を得るために、ブロックサイズを調整します。 「ブロックサイズ」フィールドの前にあるチェックボックスに画像クリック上にグリッドを重ね合わせる。 </li><li>オプションのパラメータ：自動スケーリング画像は希望の相対強度を有するマーカーが表示されていない場合（ 例えば 1色が飽和している）、またはマーカーが分析からドロップする必要がある場合は、「チャネルの強さを調整」オプションを使用します。マーカーのサブセットに細胞領域を識別するために、オプションの「しきい値のために使用されるチャネル」を使用しています。他のパラメータのデフォルトの選択は、通常は十分ですが、必要であれば、「高度な解析オプション」を使用してそれらを調整します。 </li><li>メインアプリケーションパネルの「PhenoRip」を押して、分析を実行します。 PhenoRipperは、自動的に画像内の再発のブロックタイプを識別します。表現型のプロファイルが生成されます各画像は、その中に様々なブロックタイプの分画に基づく。 </li></ol> 3。探検結果<ol><li> PhenoBrowser（ 図1）を使用して画像の表現型のプロファイル間の関係を探る。 PhenoBrowserインタフェースは、4つのパネルで構成されています。左上のパネルには、異なる画像/条件との間の相対的な類似性のグラフィカルな表現（散布図）、選択された条件の右側の表示のサンプル画像上の2パネル、および最後のパネル（棒グラフである）は、その表現型のプロファイルを比較します。 </li><li> 「データ処理」メニューを使用して &quot;空のフレームを廃棄する」。 </li><li>低品質の画像を削除する：第一に、個々の画像は、「データ処理」メニューからグループ化をオフに勉強する。次に、散布図における外れ値の点をクリックすると（ 例えば 、焦点のうち、染色アーティファクト）低品質の画像を破棄します。 </li><li>データを調べる：フィールド定義のメタデータを決定し比較の基本単位（ 例えば 、薬剤を比較し、メタデータ·フィールドの値が同じ「薬物」の画像がグループ化される必要がある）。 「グループ化」を持つ単一のデータポイントにこのメタデータ·フィールドの同じ値を持つすべてのイメージを折りたたむ。例えば、薬物によるグループ化は、薬剤ごとに1ポイントを得るために、各薬剤の中に画像を平均化する。散布図に近い（または遠隔）の点は、同様の（または異なる）細胞の表現型を引き出す条件を反映している。解釈可能を支援するために利用可能なメタデータに基づいて、色やラベルの点（データ表示]メニュー）。 3Dプロットは、「回転可能」チェック·ボックスをクリックして、左ボタンをクリックして、その上でマウスをドラッグして回転可能である。 </li><li>これらを直接比較するために2つの異なる点を選択します。画像パネルは、各ポイントのサンプル画像が表示され、バーグラフパネルは、その出現頻度が2点間の最も異なるブロックタイプが表示されます。 </li><li> Cを起動しますブロックの種類や実験条件との関係をよりグローバルな視点を提供するために、「クラスタグラムメニュー」からlustergram。ブロックの種類と状態の両方をグループ化することによって、この表現は、最良の条件のグループ（ 図5）を区別する細胞の表現型を強調しています。 </li></ol>

<ol>
	<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li><li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis.">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li><li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhenoRipper:+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images.">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li><li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations.">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li><li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images.">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li><li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+calibration+in+fluorescence+microscopy.">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li><li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis.">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).</li><li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging.">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94 (2009).</li><li>Huang, K., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+classification+of+subcellular+patterns+in+multicell+images+without+segmentation+into+single+cells.">Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells.</a> 2, 1139-1142 (2004).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここで説明するワークフローは、迅速かつ簡単に特性評価と顕微鏡画像の比較を可能にする。まず、このワークフローを迅速顕微鏡画像上の品質管理を行うことで、例えば、実験の最適化を助けることができる方法を説明しました。次に、我々は、ハイスループットスクリーニングデータを解析するための可能性を実証：我々は、それらの作用機序に基づいてグループ薬物することができた?...

過去10年間で、画像技術の急速な進歩は、多くのラボのハイスループット顕微鏡法を実行する能力を与えている。現在の課題は、分析の1に画像の1から移行している。どのように我々は、特性評価の比較、および、典型的なハイスループット撮像画面で生成された複雑なまだ微妙な表現型の急流を探索することができます？ 画像解析と情報プラットフォームの数は、画像の大規模なコレクションからの生物学的情報を抽出するためのユーザー洗練されたツールボックスの1-3を与えている。しかし、多くの重大な障害は、高スループットの画像ベースの画面からデータを分析するにとどまる。 （興味のあるシステムへの）イメージとアルゴリズムパラメータの微調整の適切な特徴付けを選択することに関わる困難さは、多くの場合、特に画像解析の専門知識を持たないユーザーのための長いセットアップ時間をもたらす。具体的には、細胞分割、内の個々の細胞を同定する工程n個の画像は、この点での主なボトルネックである。セグメンテーションは、細胞型、細胞密度、バイオマーカーなどの実験パラメータに非常に敏感であり、頻繁には大きなデータセットに対して繰り返し調整を必要とすることができる。これらの理由から、画像解析は、多くの場合、専門家ではなく、実験的なワークフローの一部として統合することによって実施した独立端末工程である。これは解析と実験の間の迅速なフィードバックサイクル、アッセイ開発の重要な部分を排除する。 ここでは、ハイスループット蛍光顕微鏡用に最適化され、前述の問題点の多くを回避している別のワークフローを記載している。この目的のために、我々はPhenoRipper 4、顕微鏡画像の迅速な調査と分析のためのオープンソース·ソフトウェア·プラットフォームを利用しています。重要なことは、PhenoRipperは、単一の細胞を同定しようとしていないことにより、細胞の分割に関わる課題の多くを避けることができます。その代わり、PhenoRipperは画素に画像を分割細胞内のサイズのブロックとそこに含まれるブロック単位で画像を特徴付ける。具体的には、PhenoRipperはマーカーの共局在ベースの機能の面でブロックをプロファイルし、自動的に訓練画像の中で最も代表的なブロックタイプの4識別します。 PhenoRipperは、各ブロック最も類似する代表的なブロックタイプに割り当て、最終的にそれらが含むブロックの種類に基づいて画像を特徴付ける。 より伝統的な単一セルベースの​​アプローチと比較すると、このアプローチは、最小限の微調整と専門知識を必要とします。ブロックサイズと閾値強度（画像の非細胞部分を破棄すること）、グラフィカルなフィードバックが設定され、どちらも：そのように、ユーザーは二つのパラメータを設定する必要があります。重要なことに、ここで説明したワークフローは、速度と最小限の微調整が大きく、時間と信頼性の向上を提供する非常に大きなデータセットに容易に拡張する4が示されている。実際には、我々はこのアプリがわかりローチは、両方の大きさは4の倍数桁のセットアップと実行に必要な時間が短縮されます。 PhenoRipperのプライマリ出力は、細胞が同様の表現型を表示させる実験条件のグループを識別することを可能にする、画像類似度を視覚的に表現したものである。一般的に見つけPhenoRipperグループ化は、より多くの時間がかかり、セル·ベースの方法4によって生成されたものに匹敵する「生物学的解釈可能」を持っている。実際には、これは、しばしば、典型的な96ウェル蛍光顕微鏡実験を行った30分以内に、前の画像解析経験のない実験者が彼または彼女の実験のパフォーマンスに関する信頼性の高い読み出しを得ることができることを意味する。実験者は次いで、異なる実験条件間の関係を探索を開始し、画像の表現型へのこれらの関係に関連することができる。 私たちは、効果を分析することによって、このワークフローを実証DNAや細胞骨格マーカーについて染色HeLa細胞上の異なるメカニズムのクラスにおける薬物の。薬の同じクラスで処理された細胞の画像がグループ化され、（というように、フォーカス細胞外染色のアーティファクト、）悪い品質の画像を識別し、潜在的に破棄するためにそれらが容易、外れ値として登場した。 このワークフローは、画像ベースの多数のアッセイのために有用であるが、別のアプローチは、潜在的に、より有益である可能性が明らかに多くの状況があります。例えば、PhenoRipperからの出力は、主に実験条件間での蛍光パターンの相対比較である。特定の単一細胞形質の絶対的特徴付けは、（セル内のスペックルの例えば数）の代わりに必要とされた場合、単一細胞ベースの分析が必要とされるであろう。それにもかかわらず、さらにこの種の状況において、PhenoRipperは、これらの単一細胞の表現型の変化を検出し、従って、アッセイの最適ための有用なツールである可能性が高いmization。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="855">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11965</td>
			<td style="width:404px;">High Glucose, L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Marker Hoechst 33342</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:404px;">DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Marker phalloidin-Alexa488</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Primary Antibody &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T9026</td>
			<td style="width:404px;">Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td>
			<td style="width:116px;">Jackson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">115-025-166</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Aldosterone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apicidin</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Colchicine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.16 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cortisol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Docetaxel</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M344</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-275</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prednisolone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RU486</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scriptaid</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :70 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taxol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinorelbine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

ハイスループット顕微鏡法の急速な進歩にもかかわらず、定量的な画像ベースのアッセイは、依然として重大な課題を提起する。専門的な画像解析のさまざまなツールが利用可能であるが、最も伝統的な画像解析ベースのワークフローは、（解析パラメータの微調整のために）急な学習曲線を持っているとイメージングと解析間の長いターンアラウンド時間をもたらす。具体的には、細胞分割は、画像内の個々のセルを識別するプロセスは、この点での主なボトルネックである。 ここでは、代替、PhenoRipper、顕微鏡画像の迅速な分析と探査のために設計されたオープンソースのソフトウェアプラットフォームに基づいて、セルセグメンテーションないワークフローを紹介。ここで紹介するパイプラインは、細胞培養の免疫蛍光顕微鏡画像用に最適化されており、最小限のユーザの介入を必要としている。 30分以内に、PhenoRipperは、典型的な96ウェル実験からのデータを解析し、画像のプロファイルを生成することができる。ユーザーことができます目視、そのデータを調査、その実験に品質管理を行う、摂動に対する応答性を確保し、反復実験の再現性を確認してください。これは、アッセイの最適化の際に非常に重要である、解析と実験の間の迅速なフィードバックサイクルを容易にします。このプロトコルだけでなく、品質管理のための最初のパス解析として有用であるだけでなく、エンドツーエンドのソリューションとして使用することができる、特にスクリーニングのため。ここで説明したワークフローは、例えば、ハイスループットスクリーニングによって生成されるような大規模なデータセットに拡張し、正確に生物系の広範囲の表現型によって基実験条件に示されている。 PhenoBrowserインタフェースは、表現型の空間を探索し、生物学的な注釈に画像のプロパティを関連付けるための直感的なフレームワークを提供します。一緒になって、ここに記載されているプロトコルは、イメージベースのスクリーニングの定量分析を採用への障壁を低くします。

ここでは、それらの作用機序に基づいてグループの薬剤に対してこのワークフローの能力を試験した。 HeLa細胞を384ウェルプレートの30ウェルに播種し、DNA /アクチン/α-チューブリンについて染色した。使用された具体的な一次抗体、蛍光標識二次抗体、および他の蛍光汚れ、材料の表に示します。ウェルを三機構的クラス（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、微小管を標的化およびDNA損傷）24?...

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Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

ここでは、急速にPhenoRipper、最近開発された画像解析プラットフォームを用いた蛍光顕微鏡画像の集合を分析し、探索するためのワークフローを記載している。

迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.1K ビュー.  UT Southwestern Medical Center. ここでは、急速にPhenoRipper、最近開発された画像解析プラットフォームを用いた蛍光顕微鏡画像の集合を分析し、探索するためのワークフローを記載している。 

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

生物学

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

蛍光顕微鏡でストロミュール頻度を可視化

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

自動化された蛍光寿命イメージング顕微鏡を利用してオープンソースのハイコンテンツな解析

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

数と明るさの分析と組み合わせた全内部反射蛍光顕微鏡による生細胞における細胞表面受容体のオリゴマー化ダイナミクス

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These processes are characterized by the gradual appearance of essential structures in the megakaryocyte cytoplasm such as a polyploid and polylobulated nucleus, an internal membrane network called demarcation membrane system (DMS) and the dense and alpha granules that will be found in circulating platelets. In this article, we describe a standardized protocol for the in situ ultrastructural study of murine megakaryocytes using transmission electron microscopy (TEM), allowing for the identification of key characteristics defining their maturation stage and cellular density in the bone marrow. Bone marrows are flushed, fixed, dehydrated in ethanol, embedded in plastic resin, and mounted for generating cross-sections. Semi-thin and thin sections are prepared for histological and TEM observations, respectively. This method can be used for any bone marrow cell, in any EM facility and has the advantage of using small sample sizes allowing for the combination of several imaging approaches on the same mouse.

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Here, we present a protocol to analyze ultrastructure of the megakaryocytes in situ using transmission electron microscopy (TEM). Murine bone marrows are collected, fixed, embedded in epoxy resin and cut in ultrathin sections. After contrast staining, the bone marrow is observed under a TEM microscope at 120 kV.

イン・シトゥ 透過電子顕微鏡を用いたネズミ巨核生物の探索

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ranging from solid-state, O2-sensitive coatings to live animal tissue samples stained with soluble O2-sensitive probes. In particular, the nanoparticle-based near-infrared probe NanO2-IR, which is excitable with a 625 nm light-emitting diode (LED) and emits at 760 nm, was used. The imaging system is based on the Timepix3 camera (Tpx3Cam) and the opto-mechanical adaptor, which also houses an image intensifier. O2 phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM) is commonly required for various studies, but current platforms have limitations in their accuracy, general flexibility, and usability.
The system presented here is a fast and highly sensitive imager, which is built on an integrated optical sensor and readout chip module, Tpx3Cam. It is shown to produce high-intensity phosphorescence signals and stable lifetime values from surface-stained intestinal tissue samples or intraluminally stained fragments of the large intestine and allows the detailed mapping of tissue O2 levels in about 20 s or less. Initial experiments on the imaging of hypoxia in grafted tumors in unconscious animals are also presented. We also describe how the imager can be re-configured for use with O2-sensitive materials based on Pt-porphyrin dyes using a 390 nm LED for the excitation and a bandpass 650 nm filter for emission. Overall, the PLIM imager was found to produce accurate quantitative measurements of lifetime values for the probes used and respective two-dimensional maps of the O2 concentration. It is also useful for the metabolic imaging of ex vivo tissue models and live animals.

This paper describes the use of a new, fast optical imager for the macroscopic photoluminescence lifetime imaging of long decay emitting samples. The integration, image acquisition, and analysis procedures are described, along with the preparation and characterization of the sensor materials for the imaging and the application of the imager in studying biological samples.

生物医学アプリケーション向けの蛍光寿命マクロイメージャ

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...