この方法により、P3HR1細胞株からエプスタインバーウイルス粒子を単離し、ウイルスストックを定量して、さまざまな研究目的に使用することができます。この技術の主な利点は、EBウイルスストックを調製するための比較的容易で、安価で、高速で、信頼性の高い方法を提供することです。この技術によって製造されたバイタル粒子は、EB.To の診断のために多くのin vitroまたはin vivo実験モデルに使用でき、15ミリリットルの円錐管に細胞懸濁液Aの体積を調製し、100ミリメートル培養プレートに対して細胞数が約220万細胞になるように体積を調整する。
5ミリリットルの完全培養液をチューブに加えます。80マイクロリットルのジメチルスルホキシドをチューブに加える。次に、1ミリリットルのPMAあたり1ミリグラムの350マイクロリットルをチューブに追加します。
PMAの最終濃度はミリリットルあたり35ナノグラム、DMSOの最終濃度は0.08%の総容量が10ミリリットルになるように4.27ミリリットルの培地を追加します。チューブの内容物を傾けて混合し、内容物を100ミリメートルの培養プレートに移します。プレートを細胞培養インキュベーターに摂氏37度、5%二酸化炭素で5日間放置します。
インキュベーター内で5日間後、プレートの内容物を120Gで8分間遠心分離して細胞をペレット化し、細胞ペレットを無細胞ウイルス含有上清を回収し、細胞ペレットを廃棄する。再び上清を摂氏4度で90分間16, 000Gで遠心分離し、ウイルス粒子をペレット化した。上清を廃棄し、ウイルスペレットを5ミリリットルの培養液に再懸濁し、ウイルス懸濁液をそれぞれ250マイクロリットルのウイルス懸濁液を含む20本のチューブに分注し、懸濁液を摂氏マイナス80度で保管します。
DNAからタンパク質を分離するには、ウイルス製剤を含むチューブの1つに500マイクロリットルのトリス飽和フェノールを加えます。100マイクロリットルの水とボルテックスをよく加えて、ピンク色のエマルジョンを得ます。9, 650 Gで15分間遠心分離し、上清を集めて新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。
冷酢酸ナトリウムの上清量の10分の1に相当する量を加え、上下にピペッティングして混合します。次に、1ミリリットルのグリコーゲンあたり20ミリグラムの1マイクロリットルを加え、ピペッティングで混合します。上清の3倍の量の冷たい100%エタノールを加え、摂氏マイナス80度で一晩保存します。
ウイルスDNA遠心分離機を摂氏4度で15分間9, 650 gで単離する。上清を捨ててDNAペレットを得、ペレットを1ミリリットルの冷70%エタノールで3回洗浄した。再び9, 650 Gで15分間遠心分離し、上清を捨てます。
ペレットを約10分間風乾した後、ペレットを10〜50マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離蒸留水に再懸濁する。サンプルを摂氏マイナス20度で保存して後で処理するか、摂氏4度で一晩保存してDNAを最大限に溶解し、その後マイナス20°Cで保存します。繊細なタスクワイパーでマイクロ分光光度計の台座を洗浄した後、準備されたDNAサンプルを1マイクロリットルロードし、サンプル中のDNAの濃度をメモします。
260〜280ナノメートルと260〜230ナノメートルの両方の吸光度の比率を確認してください。DNAは260ナノメートル、タンパク質は280ナノメートル、フェノールなどの有機物は230ナノメートルで吸収します。リアルタイムPCRには1.8対2の比率で十分と考えられます。
PCR反応ミックスを調製するには、5マイクロリットルのサイバーグリーンリアルタイムPCRミックスを0.2ミリリットルのPCRチューブに入れます。各チューブに、フォワードプライマー1マイクロリットルあたり7.5ピコモルを1マイクロリットル、リバースプライマー1マイクロリットルあたり7.5ピコモルを1マイクロリットル加えます。ここで、EBV低分子RNA2遺伝子が増幅される。
EBVゲノムコピー数を決定する。次に、2マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水と1マイクロリットルのウイルスDNAをチューブの1つに加えます。反応混合物の総容量は10マイクロリットルである。
既知のEBVゲノムコピー番号を持つ標準物質として使用される他のチューブを準備します。PCR混合物を、摂氏95度で5分間活性化する最初のステップから始めます。次に、摂氏95度で15秒間、摂氏58度で30秒間40サイクルします。
すべてのデータシートをCSVファイルとしてエクスポートし、標準チューブあたりのEBVゲノムコピー数と平均CQ値のログを計算します。ゲノムコピー数の対数に対して標準のCT値をプロットすることにより、qPCR標準曲線を生成します。標準曲線プロット式を採用して、誘導されたウイルスDNAを含むPCRチューブ内のEBVゲノムコピー数を導出する。
最後に、画面に表示される式を使用して、誘導されたウイルス製剤の濃度を計算します。ここで、Xは標準曲線に由来するEBVゲノムコピーの数であり、FはPCR反応ごとにDNAを設定するために使用される希釈係数です。血球計算盤チャンバーを用いた細胞計数がここに示されている。
4つの象限は、光学顕微鏡を使用してカウントされます。ここでは、青で示されているセルはカウントする必要がありますが、赤で示されているセルは、象限の上、右、下、または左の境界線に接触しているため、カウントしないでください。最も多くのEBV粒子を生成するPMAおよびジメチルスルホキシドの濃度を決定するために、最適化試験が実施された。
DMSO濃度0.8%、PMA濃度35ナノグラム/マイクロリットルが最適であり、EBV濃度が高くなりました。私たちの研究室では、この技術によって生成された重要な粒子を使用して、このウイルスに対する自己免疫または炎症反応を調べました。また、新規抗EBV剤の開発にも取り組んでいます。
