我々は感謝して博士の重要な貢献を認識する。ジョンアンダーソン、アンドリューメインと本研究へのシャーリーティレル。この作業は、疾病管理予防（U50/CCU116806-01-1）と米国農務省（58-6615-1-218、CONH00768、およびCONH00773）センターからの補助金によって部分的にサポートされていました。

1。蚊のソートと同定<ol><li>次の手順は、ライブ蚊で動作するように訓練されているスタッフが、専用のバイオセーフティレベル2（BSL - 2）実験室でのオープンラボのベンチ上で実行されます。 &quot;コールドチェーン&quot;は、プロシージャ全体で維持されます。 </li><li> 5分間-20℃の冷凍庫で蚊コレクションのバッグを置くことで成虫に住んで麻酔。ドライアイスを含む断熱容器に回収袋を転送します。蓋を閉じて、ノックダウンを完全に保証するために1〜3分間、二酸化炭素に蚊を公開。 </li><li>ドライアイスのベッドの上に置かれたプレ冷やした皿に麻酔蚊をタップします。細かい鉗子とプラスチック部分のコップの位置を使用して別々の個々のメスの蚊。濡れた氷の上に蓋と場所カップをカバー。 </li><li>電子冷却テーブルに取り付けられたステレオ解剖顕微鏡（10 - 60Xズーム）の助けを借りて、外部の蚊の形態に基づいて説明的な分類学のキーを使用して、種の蚊を識別します。 </li><li>銅のBBを含む2mLのスナップキャップバイアルの≤50人のプールに蚊種を同定組み合わせる。バイアルは、一意の識別子でラベル付けされます。 </li><li>すべての蚊の識別に続いて、バイアルは、ラベルの付いた袋に配置され、ドライアイスを含む発泡スチロールのクーラーで開催。 </li><li>ウイルス検査まで-80℃のフリーザーで蚊プールを保管してください。 </li></ol> 2。蚊からウイルスを分離するバイオセーフティに関する注意事項<ol><li>以下の手順は、封じ込め1のこのレベルで動作するように訓練されているスタッフによるバイオセーフティーレベル3（BSL - 3）実験室で行われる。実験室の設備、機器、手続及び慣行は、機関、州、および連邦政府の監督と検査の対象となります。次のプロトコルを試行する前に、適切な訓練と承認を求める。 </li><li>使い捨てガウン、手袋、フェイスシールド、および呼吸器などの各手順については、適切な個人用保護具（P​​PE）を着用してください。 </li><li>完了手続きの前と後に70％アルコールで作業面を消毒する。 </li><li>細胞培養と感染性物質はクラスIIバイオセーフティキャビネット（BSC）で処理されます。 </li><li>蚊プールは、BSCの内部に配置されているミキサーミルでホモジナイズされています。 </li><li>蚊のホモジネートは、エアロゾル、タイトなマイクロ遠心機で遠心分離されています。この手順はBSC内で実行できない場合に遠心分離機からサンプルを操作し、取得する際に、演算子は、人工呼吸器を着用してください。 </li><li> BSC（バイオセーフティキャビネット）で材料を処理するピペットとピペットチップは前にオートクレーブ〜10％の漂白剤に浸漬されています。すべての実験室の廃棄物は、廃棄前にオートクレーブして除染されている。 </li></ol> 3。 Vero細胞の調製<ol><li>漂白剤を含む廃棄物のビーカーにコンフルエントVero細胞（クローンE6）の一つの大きな組織培養フラスコ（175cm 2の ）からデカント培地。 </li><li> 5mLのPBS物のアリコートと細胞の層上に、徹底的に全体の単分子層をカバーすることを確認してフラスコの側面に沿って渦を追加することで、Vero細胞を洗う。 </li><li>廃棄物のビーカーにデカントPBS。 </li><li>トリプシン- EDTAと全体の単分子層を徹底的にカバーすることを確認し、細胞の層の上に渦の2.5 mLを加え。 </li><li> 37℃で5分間インキュベーターにフラスコをインキュベート° C、5％CO 2。 </li><li>ゆっくりと底面から細胞を除去するためにフラスコを振ると渦巻き。細胞が簡単にオフにスライドするはずです。細胞が簡単に滑り落ちるいない場合は、さらに1〜5分間インキュベートする。 </li><li>細胞の塊を分割し、上下10〜20倍血清ピペットとピペットを用いて、最小必須培地（MEM）、5％ウシ胎児血清（FBS）5 mLを追加します。 </li><li> 22.5 mLの総ボリュームに対して追加15mlのMEM、5％FBSを加え、よく混ぜる。 </li><li>直立2台のラック（20フラスコ/ラック）40小さな組織培養フラスコ（25cm 2の ）場所。 </li><li>バイオセーフティキャビネット内部のフラスコを含むラックを置き、直接フラスコの前にキャップを置き、フラスコのキャップを取り外します。 </li><li>血清学的ピペットを使用して、各フラスコにMEM、5％FBSを4mLを分注する。 </li><li>各フラスコに0.5mlの細胞懸濁液を分注する（〜1時06分割比）フラスコのキャップを交換してください。 </li><li>残りの細胞懸濁液（約2.5 MLS）を含む元の大きな組織培養フラスコに戻ってMEMを50mL、5％FBSを追加し、インキュベーターにフラスコを返します。同じ大規模な組織培養フラスコを5継代まで再利用されるかもしれないし、新しいフラスコは、それを置き換えるために、設定する必要があります。 </li><li>トレイのスタックに小さな組織培養フラスコを置きます。渦巻メディアが一様にflaksの底をカバーしていることを確認するトレイ。 </li><li> ° C、5％CO 2は、37℃インキュベーターで小さなフラスコを置き、80〜90％コンフルエントになるまで一晩成長する。 </li></ol> 4。蚊のプールの準備<ol><li>テスト手順の間に蚊プールは冷やしておく。あらかじめ冷却に使用します冷凍庫のラックとミキサーミルカセット、氷冷試薬、および冷却遠心蚊の処理プール。 </li><li>場所チューブはあらかじめ冷却冷凍庫のラックに蚊を含むと1を追加 - 1.5mLのPBS - Gを蚊の各チューブに。 </li><li>冷凍庫からミキサーミルカセットを取り出す。ミキサーミルで固定し、各カセットに24チューブをセットし、。 </li><li> 25サイクル/秒で4分間、サンプルをホモジナイズする。ミキサーミルは、蚊の組織を破壊する各管の内部に高い速度と金属製のBBでチューブを交わしている。 </li><li> 7,000 rpmで6分間チューブを遠心する。 </li><li> Vero細胞に接種するまでバックフリーザーラックにチューブを置きます。 </li></ol> 5。蚊プールホモジネートによるVero細胞の接種<ol><li>十分なコンフルエンシーと細胞の健康を確保するために、倒立顕微鏡下でそれぞれのシリーズから少なくとも一つの組織培養フラスコをチェックして、80〜90％範囲については期待しています。 </li><li>ラインアップ各蚊プールから対応するアクセッション番号とラックとラベルのフラスコに20の小さな組織培養フラスコを。 </li><li>キャップを緩めて、廃棄物のビーカーに組織培養フラスコからのメディアのほとんどをデカントする。完全にコートの細胞単層にフラスコ内に十分なメディアにしておきます。 </li><li>対応する組織培養フラスコに各処理蚊のプールからの上清のアリコート100μL。 </li><li>培養フラスコのキャップを取り付けて締めます。 </li><li> 35〜40 rpmで5分間（室温）のためにシェーカーで培養フラスコを寝かせて。 </li><li> BSCのラックと場所で直立位置に20組織培養フラスコを返します。 </li><li>一度で3組織培養フラスコをUncapping、血清学的ピペットを使用して、各フラスコに4 mLの増殖培地を分注し、キャップを交換してください。 </li><li>ピペットチップは、培養フラスコの首や唇に接触しないようにしてください。接触がフラスコで作られている場合は、必要に応じてピペットチップを変更してください。 </li><li> 37組織培養フラスコをインキュベート° C、5％CO 2を 。 </li></ol> 6。ウイルス増殖のためのVero細胞をスクリーニング<ol><li>画面には3-7日後に接種から、ウイルス感染の兆候、細胞変性効果（CPE）のために組織培養フラスコに接種した。 </li><li>視覚的傾斜によるCPEおよび/または汚染のための細胞培養フラスコを検査し、フラスコの下部にあるプールというメディアを検討。細胞がCPEの間に劣化や酵母、真菌、または細菌汚染の成長に起因するとして、メディアが濁って表示されます。 </li><li>倒立顕微鏡下で曇りのメディアを示す細胞培養を再検討する。ウイルスは細胞が変形したり、培養フラスコから緩んで壊れてしまう原因になります。目に見える汚染物質による細胞培養、例えば、酵母、他の細菌、真菌や重い蚊の破片は、0.22μMシリンジフィルターを通してオリジナルの蚊のプールを渡すことによって、再テストされています。 </li><li>無菌的に血清用ピペットを用いて標識クリオチューブにウイルス陽性細胞の培養物からのメディアの1〜2 MLSを分注する。 </li><li>適切な診断アッセイを用いて同定されるまで、ウイルスの培養液を-80℃で保存されています。 </li></ol> 7。試薬の調製<ol><li> MEM、5％FBS。 DD H 2 0の4リットルの最終容量に粉末MEMの37.6 gを溶かす。メディアボトルとオートクレーブで500 mLのアリコートにソリューションを分注する。溶液を冷却しているときは、無菌的に各ボトルに26mlの熱不活化ウシ胎児血清、5.2 mLのL -グルタミン、5.2 mLのanti-biotic/mycotic、と10.4 mLの7.5％重炭酸ナトリウムを加える。 4℃で保存します。 </li><li> PBS - G。 16グラムのNaCl、0.4グラムのKCl、2.3グラムのNa 2 HPO 4、0.4グラムのKH 2 PO 4、および0.5％フェノールレッドの4 mLの1000mLのDD H 2 Oに溶解する。 2NのNaOH（必要に応じて）で7.1から7.4へのpHを調整する。別のビーカーに、沸騰のH 2 Oの熱600mLの。ホットプレートから削除、10グラムゼラチンを追加し、溶解する。 PBS溶液に溶解してゼラチン溶液を追加し、dd H 2 Oで2リットルに最終的な音量を調節ボトルとオートクレーブ中に溶液100 mLを分注する。溶液を冷却しているときは、無菌的に42.8 mLの熱不活化ウサギの血清および1.4 mLのanti-biotic/mycoticを追加します。 4℃で保存します。 </li><li> PBSの細胞の洗浄。 400mLのDD H 2 Oに50 mLの10XダルベッコのPBSを追加2 N NaOHで7.1にpHを調整する。 DD H 2 Oで500 mlに最終的な音量を調節する0.2uM真空フィルタユニットとフィルターソリューション。 8 mLのスクリューキャップチューブに5mLのアリコートに分注する。 4℃で保存します。 </li></ol> 8。代表的な結果 4分類の家族からのウイルスの9種類は、1997年から2010年（表1）からコネチカット州の連続的な州全体の監視中に収集された蚊から回収された。これらのウイルスのうち5つは、ヒトの疾患、西ナイルウイルスと東部ウマ脳炎ウイルスであることの最も重要な病原体を引き起こすことが知られている。新たな発見が含まれます：で収集された蚊からのWNVの最初の単離を1999 2北米、2005年4 2000 3における米国北東部のポトシウイルスの最初の単離、及びニューイングランドのラクロスウイルスの最初の単離。 <table border="1"><tbody><tr><td> ウイルス </td><td> ファミリー </td><td> 号の分離株 </td><td> 番号の場所 </td><td> いいえの年は、検出された </td><td> ヒトの疾患 </td><td> 文献。 </td></tr><tr><td>ウエストナイルウイルス</td><td>フラビウイルス科</td><td> 1002 </td><td> 94 </td><td> 12 </td><td>激しい、発熱、脳炎に中等度の</td><td> 2,5 </td></tr><tr><td>東部ウマ脳炎ウイルス</td><td>トガウイルス科</td><td> 292 </td><td> 41 </td><td> 10 </td><td>深刻な、脳炎</td><td> 6,7 </td></tr><tr><td>高地Jウイルス</td><td>トガウイルス科</td><td> 178 </td><td> 39 </td><td> 11 </td><td>知られていない</td><td> 6 </td></tr><tr><td>ジェームズタウンキャニオンウイルス</td><td>ブニヤウイルス科</td><td> 305 </td><td> 74 </td><td> 14 </td><td>軽度から中等度、発熱、髄膜炎</td><td> 8 </td></tr><tr><td>ポトシウイルス</td><td>ブニヤウイルス科</td><td> 259 </td><td> 76 </td><td> 4 </td><td>知られていない</td><td> 3 </td></tr><tr><td>キャッシュバレーウイルス</td><td>ブニヤウイルス科</td><td> 114 </td><td> 51 </td><td> 8 </td><td> two文書化された場合には深刻な、発熱、神経の病気への軽度の</td><td></td></tr><tr><td> Trivittatusウイルス</td><td>ブニヤウイルス科</td><td> 83 </td><td> 21 </td><td> 11 </td><td>知られていない</td><td></td></tr><tr><td>ラクロスウイルス</td><td>ブニヤウイルス科</td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td>深刻な、脳炎に中等度の</td><td> 4 </td></tr><tr><td>フランダースウイルス</td><td>ラブド</td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 2 </td><td>知られていない</td><td></td></tr></tbody></table> 表1。ウイルスは、ベロ細胞培養アッセイにより、フィールド収集した蚊に検出された。蚊は、1997年から2010年からコネチカット州の州全体の監視中に収集された。

<ol>
	<li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2007).</li><li>Anderson, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+West+Nile+virus+from+mosquitoes,+crows,+and+a+Cooper's+hawk+in+Connecticut.">Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut.</a> Science. 286, 2331-2333 (1999).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Potosi+virus+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+collected+in+Connecticut.">Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut.</a> J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+genetic+variant+of+La+Crosse+virus+(Bunyaviridae)+isolated+from+New+England.">A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England.</a> Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+West+Nile+virus+in+Connecticut,+USA:+a+five+year+analysis+of+mosquito+data+1999-2003.">Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+isolations+of+eastern+equine+encephalitis+and+highlands+J+viruses+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+during+a+1996+epizootic+in+southeastern+Connecticut.">Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut.</a> J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eastern+equine+encephalitis+virus+in+mosquitoes+and+their+role+as+bridge+vectors.">Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors.</a> Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Jamestown+Canyon+virus+(Bunyaviridae:+Orthobunyavirus)+from+field-collected+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+in+Connecticut,+USA:+a+ten-year+analysis,+1997-2006.">Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).</li><li>Beaty, B. J., Calisher, C. H., Shope, R., Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11.">Chapter 11.</a> Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , 189-212 (1995).</li><li>Karabatsos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , (1985).</li><li>Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+west+nile+virus+from+human+clinical+specimens,+field-collected+mosquitoes,+and+avian+samples+by+a+TaqMan+reverse+transcriptase-PCR+assay.">Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay.</a> J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).</li><li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays.">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ベロ細胞培養アッセイは、ウイルスの多様性のためのスクリーンのフィールドに収集蚊に効果的な方法として機能します。これは、特にいずれか興味のあるいくつかのウイルスを標的分子の方法とは対照的です。また、我々は、ヴェロ細胞培養アッセイが均等にRT - PCR 7より多くの敏感な場合ではないと今後の研究のために私達の参照のコレクションに格納されているウイルス分離株?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/装置の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> GIBCO - インビトロジェン</td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Anti-biotic/mycotic </td><td> GIBCO - インビトロジェン</td><td> 15240 </td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウムNaHCO 3を 、7.5％のSoln。 </td><td> GIBCO - インビトロジェン</td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L -グルタミン200mmの100倍</td><td> GIBCO -インビトロジェン</td><td> 25030 </td></tr><tr><td>粉末状の最小必須培地（MEM） </td><td> GIBCO - インビトロジェン</td><td> 11700 </td></tr><tr><td> 10XダルベッコPBS </td><td> GIBCO - インビトロジェン</td><td> 14080 </td></tr><tr><td>トリプシン- EDTA </td><td> GIBCO - インビトロジェン</td><td> 15400 </td></tr><tr><td>ウサギ血清</td><td> GIBCO - インビトロジェン</td><td> 16120 </td></tr><tr><td> Vero細胞（クローンE6） </td><td> ATCC </td><td> CRL - 1586 </td></tr><tr><td>小さ ​​な組織培養フラスコ、ベントキャップ、25cm 2の </td><td>ファルコン - ベクトンディッキンソン</td><td> 353112 </td></tr><tr><td>大規模な組織培養フラスコ、ベントキャップ、175cm 2の </td><td>ファルコン - ベクトンディッキンソン</td><td> 353108 </td></tr><tr><td>銅でコーティングされたBBの、4.5ミリメートル</td><td> Crosman </td><td> 0767 </td></tr><tr><td>ミキサーミル</td><td>レッチェ</td><td> MM300 </td></tr><tr><td> Isopackのフリーザーラック</td><td>エッペンドルフ</td><td> 022510240 </td></tr></tbody></table>

detection of infectious virus from field-collected mosquitoes by vero cell culture assay

蚊は、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、およびchickungunyaウイルスとして重要なヒト病原体などの異なるウイルスの数を送信する。これらのウイルスの多くは彼らの流行の範囲で激化し、新しい地域に拡大し、これらの脅威に対応するための効果的な監視と制御プログラムを必要としている。ウイルスの活動を監視する一つの戦略は、流行のサイトから蚊が大量に収集し、ウイルス感染のためにそれらをテストして。この記事では、我々は、プロセスを処理する方法について説明し、画面のヴェロ細胞培養アッセイにより感染性ウイルスのための蚊をフィールド集めた。蚊は、トラップの位置や種によって並べ替え、および≤50人を含むプールにグループ化されます。プールされた標本は、ミキサー、ミルと水相がコンフルエントVero細胞培養（クローンE6）に接種している使用して緩衝生理食塩水でホモジナイズされています。細胞培養は、日3月7日、接種後から細胞変性効果のために監視され、細胞培養で増殖したウイルスは、適切な診断アッセイによって識別されます。このアプローチを利用することにより、我々はコネチカット、米国で収集された蚊から9種類のウイルスを分離しており、これらのうち、5はヒトの疾患を引き起こすことが知られている。これらのウイルスのうち3つは（ウエストナイルウイルス、ポトシウイルス、そしてラクロスウイルス）北米または1999年以来、ニューイングランド地方のための新しいレコードを表します。ウイルスの広い多様性を検出する能力は、蚊の人口に設立され、新たに出現したウイルスの両方を監視することが重要です。

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay at JoVE.com

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

我々はプロセスに方法を記述し、画面のヴェロ細胞培養アッセイによりウイルスの多様性のための蚊をフィールド集めた。この手法を採用することにより、我々はコネチカットで収集された蚊の4分類の家族から9種類のウイルスを検出した。

Vero細胞培養アッセイによるフィールドコレクト蚊から感染性ウイルスの検出

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

detection-infectious-virus-from-field-collected-mosquitoes-vero-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.3K ビュー.  The Connecticut Agricultural Experiment Station. 我々はプロセスに方法を記述し、画面のヴェロ細胞培養アッセイによりウイルスの多様性のための蚊をフィールド集めた。この手法を採用することにより、我々はコネチカットで収集された蚊の4分類の家族から9種類のウイルスを検出した。

ビデオ: Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Alphaherpesウイルス順行性輸送とスプレッドの生細胞イメージング

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

免疫・感染学

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

感染症のためのモデルとしてのオルガノイド：人間の文化とマウス胃オルガノイドとピロリ菌のマイクロインジェクション

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

ジカウイルス感染細胞培養系と<em&gt;インビトロ</emインターフェロンの&gt;予防効果

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

迅速・安全・簡易マニュアル ベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの病原性を研究するためのEx Vivo鶏ファブリキウス嚢細胞培養モデル

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

マウスと次世代シーケンサーによるひと抗体のレパートリーの同定

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

細胞ベースのアッセイによるひと血清抗アクアポリン 4 免疫グロブリン G の検出

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

ウイルスから離れた高収率細胞外小胞製剤の精製

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...