この研究は、NIHの助成金K08 AI062732、K12 HD001401、および1UL1RR024139 - 02とチャールズHフード財団からのSB - Mへの母子保健の研究助成金によって賄われていた。とニューヨーク州立大学ストーニーブルック校での研究の財団。

1。 EBV株の準備<ol><li>無菌操作を用いて75センチメートル2の組織培養フラスコに3 × 10 5細胞/ mlで、指数関数的にB95 - 8細胞を（13 ATCC＃CRL 1612）成長サブカルチャー。細胞は37℃で0.5μg/ mlでそれぞれ10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン/ 100U/mlでストレプトマイシンおよび100μg/ mlを含む完全RPMI 1640中で成長し、アンホテリシンBされています° Cの存在下で5％CO 2の。 </li><li> 48時間後、1 × 10 6細胞/ mlの新鮮な完全RPMI 1640に再懸濁し、細胞。ウイルス産生を誘導するために、標準的なCO 2インキュベーターで1時間、20ng/mlテトラデカノイルホルボールアセテート（TPA）で細胞を刺激する。 TPAを削除するには、RPMI 1640で細胞を3回洗浄する。 </li><li>完全RPMI 1640（1.2から）の元のボリュームに細胞を再懸濁し、96時間CO 2インキュベーターにフラスコを置く。このメソッドは、感染性ウイルスの額面の高い力価を生成することが示されているticles 6。 </li><li> ° C細胞からEBVを含む培養上清を分離するために4℃10分間600 × gで遠心する。一年以上-70 0.45ミクロンフィルター、分注し、そして店舗° Cを介してフィルター上清。 代替は、ATCC（VR - 1492）からEBVを含むB​​95 - 8細胞から上清を取得し、ATCCの推奨する希釈して使用することです。 </li></ol> 2。末梢血単核細胞（PBMC）の単離<ol><li>ヘパリン化シリンジまたはヘパリン添加血液チューブにドナーから10 mlの血液を描画します。 50 mlコニカルチューブに室温で20 mlのPBSで血液を希釈する。 </li><li>アンダーレイは、15ミリリットルフィコールハイパックリンパ球分離培地で血液を希釈。 30分間室温でブレーキなしで225 × gで遠心する。 </li><li>新しい50 mlコニカルチューブにバフィーコートと転送を削除します。 PBSで50mlにボリュームを上げ、10分間室温で600 × gでスピン。 </li><li> POU上清をオフR。 50ミリリットルのPBSでペレットを再懸濁し、10分間室温で600 × gで回転することで細胞を洗浄する。同様の方法でさらに2回洗浄する。 </li><li>再懸濁し、完全なRPMI 1mlに細胞を洗浄した。トリパンブルー1 / 10希釈を準備するために細胞の5μLを使用してください。血球計算板を用いて生細胞を数える。 </li><li> 2 × 10 6 / mlの細胞濃度を得るために25cm 2の組織培養フラスコで完全RPMIを使用して音量を調整します。 </li></ol> 3。 EBVによる感染<ol><li> 2.6から20nMの最終濃度を細胞懸濁液にFK506（AGサイエンティフィック）を追加します。 37℃CO 2インキュベーター内で場所のフラスコで1時間のためのC。 </li><li>急速にEBVのアリコートを解凍。インキュベーターからフラスコを取り外し、1 / 10希釈で細胞にEBVを追加します。通常は、この希釈はMOI 50-100を提供します。 37℃CO 2インキュベーター内で直立それをミックスして配置するスワールフラスコ℃に</li></ol>番目の点に注意してください。ステップ4で、成功した結果を予測するために実行、オプションの手順です。ステップ4が実行されることになっている場合は、コントロールとして2 × 10 6細胞/ mlで非感染PBMCの追加のフラスコを培養する必要があります。 4。細胞の増殖をを識別する（オプションの手順） <ol><li> PBS + 5％FBS：FACSバッファを準備します。 4℃で保存します。 </li><li>以下の抗体を作るステップ4.6で細胞を染色するために50μLボリュームでそれぞれをミックス。抗体の希釈液は、抗体によって非特異的結合を阻害するマウスIgG（シグマ）の1mg/mlを含むFACS緩衝液で行う必要があります。 <ol class="lroman"><li> PE標識抗CD23抗体（1 / 50希釈）を持つ単一の染色</li><li> FITC結合抗CD58抗体（1 / 50希釈）を持つ単一の染色</li><li> PE - Cy5を結合抗CD19抗体（1 / 50希釈）を持つ単一の染色</li><li> CD23、CD58、およびCD19（1 / 50希釈ごと）のための三重染色</li><li> PE結合体化アイソタイプコントロールを持つ単一の染色CD23 - PE（抗CD23抗体と同じ濃度で）にマッチした抗体</li><li> CD58 - FITC（抗CD58抗体と同じ濃度で）にマッチしたFITC標識アイソタイプコントロール抗体を持つ単一の染色</li><li> CD19 - PE - Cy5標識（抗CD19抗体と同じ濃度で）にマッチしたPE - Cy5を結合した​​アイソタイプコントロール抗体を持つ単一の染色</li><li>すべての3つのアイソタイプコントロール抗体で三重染色。 </li></ol>一時的に暗所で4℃でミックスを保存する。 </li><li>より均一な細胞懸濁液を得るためのEBV、優しくスワールフラスコへの日帰りで3つのポスト露出。 2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブにフラスコから2ミリリットルを削除します。 3分間室温で3000rpmで遠心チューブをスピン。 </li><li> 5 × 10 6〜1 × 10 7細胞/ mlのFACS緩衝液で清と再懸細胞を吸引除去する。 </li><li>個々のエッペンドルフチュー​​ブや96ウェルV底板8つの50μlのアリコートを削除します。スピンチューブまたは1500 × gでプレート3分間。 </li><li>上清と渦管/プレートを捨てる。 4.2で作成した適切な抗体の希釈液を含むFACS緩衝液50μLの各チューブ/ウェルの細胞を再懸濁します。 </li><li> 30分間暗所で氷上でチューブ/プレートをインキュベートします。 3分間3000rpmで遠心分離細胞は、上清を除去、およびFACS緩衝液200μlを加える。再び細胞を遠心分離し、洗浄を完了するために上清を取り除く。さらに2つの洗浄を繰り返します。 </li><li> 200μLのFACS緩衝液に懸濁し、フローサイトメーターを使用してデータを取得し、20,000イベント/チューブを獲得する。 </li><li> WinMDI（PC上でFACSのデータ解析のためのフリーウェア）を使用してデータを分析する。前方と側方散乱プロファイルを使用して生細胞にゲートを。その後、抗CD19抗体にマッチしたアイソタイプコントロール抗体で染色した細胞と比較して後にCD19 +（B細胞マーカー）の発現のためのゲート生細胞。プロットCD19 +ライブB y軸上のx軸とCD58の蛍光強度でCD23の蛍光強度を持つ細胞。マッチしたアイソタイプコントロール抗体で染色したEBV -曝露した細胞と比較することによりCD23 +およびCD58 +細胞を決定する。 EBV -露出文化のCD23 ハイ CD58 +細胞（図2C）の存在は、EBVに感染した成長形質転換細胞の正常な伸長を予測している。対照的に、CD23 ハイ CD58 +細胞は、細胞がEBV（図2A）にさらさまたはEBVの非不死化株（図2B）に公開されていないときに出現しません。 CD23 ハイ CD58 +細胞は、実験的に増殖を起こし、その後、LCLを（14）を確立することが実証されている。 </li></ol> 5。 LCLの拡大と凍結保存<ol><li>光顕微鏡による細胞の可視化：EBV感染後一週間で、細胞のクラスターは、光学顕微鏡で見ることができます。図3は、フラスコの早い段階で微細なクラスター（図3B）の例を示しています。 </li><li>時間が進むにつれて、微細なクラスターとなるような塊が見える大きくなります肉眼フラスコインチ図3Cは、光学顕微鏡により設立されたLCLの細胞の大規模なクラスタを示しています。 </li><li>細胞を供給する：12日目に培養フラスコで培養液の量を2倍にしてください。その後、完全RPMIを使用して、そのボリューム2〜3倍に増やすことによって文化を展開します。 </li><li>摂食細胞の周期性は、細胞増殖の速度に基づいて決定されるべきである。培養液が黄色に変わったら、それは一般的に上記のようにメディアを交換する時期です。通常、これは1週間に1回発生します。ただし、一部の細胞株は、多かれ少なかれ頻繁に供給する必要があります。今後数週間にわたって75〜100ミリリットルの文化を展開します。 </li><li>凍結保存：室温で10分間細胞を、600 × gで遠心細胞を凍結。 1 × 10 7細胞/ mlで、90％FBSを含む冷凍結培地および10％ジメチルスルホキシドで上清と再懸細胞ペレットを取り外します。液体窒素でチューブを置きます。 </li></ol> 6。代表的な結果： 成功した結果は、CD23 ハイ CD58 +細胞の存在によって予測されている。約EBVへの曝露後3〜4日で生きている細胞の2-3％は、（図2C）、このプロファイルを持つ必要があります。他のCD23のサブ集団+、CD23 - 、CD58 +、及びCD58 -細胞がEBVへの曝露後に最小限の増殖14を示す観察。 HH514 - 16細胞（図2B）からEBVへの曝露非感染細胞（図2A）と、細胞は、EBVの非不死化株を保有する、CD23 ハイ CD58 +細胞を示していない。 また、成功を監視するために光学顕微鏡で細胞を可視化することができる：前述のように、EBVの感染後一週間以内に、フラスコ中の細胞の小さなクラスターは、光学顕微鏡（図3B）で表示されます。時間の経過と細胞がLCLへと発展するように、微細なクラスターは（3C図）塊がフラスコ内に肉眼で見えるように大きくなる。 図1。リンパ芽球様細胞株の生成と凍結保存のためのワークフロー。末梢血液をフィコール勾配を通じて遠心分離される。確立された勾配のバフィーコートのPBMCの存在は、EBVの添加により、続いFK506にさらされています。 EBV -曝露した細胞を37℃で確立し、その後、凍結保存用のLCLを拡大するため、5％CO 2の存在下で増殖されています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig2.jpg" /> 図2。EBVへの曝露後に増殖を受けることが予想されるB細胞の亜集団の同定。 HH514 - 16細胞（B）から、またはFK506の存在下でB95 - 8細胞は（C）3日目に収穫したから派生したEBVにさらされる非感染PBMC（）またはPBMC。細胞はCD19、CD23、およびCD58に対して指向の蛍光標識抗体で染色した。生細胞のゲーティング後の、非感染（）及びEBV -露出（BおよびC）CD19 + B細胞はCD23およびCD58の発現について調べた。 CD58を発現するB細胞とCD23（CD23 ハイ CD58 +）の高レベルの亜集団は、変換有能なEBV（B95 - 8細胞に由来する）に曝露した細胞でのみ観察された、描かれています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig3.jpg" /> 図3。EBV感染細胞の細胞クラスターの可視化。 PBMCは、FK506で処理し、EBVに感染していた。非感染（A）及びEBV -露出（B）細胞は位相差顕微鏡（10倍の倍率）が一週間後に感染を調べた。五週齢のリンパ芽球様細胞株は、Cで示されています

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Gene Ther. 13, 815-827 (2002).</li><li>Kuppers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+under+influence:+transformation+of+B+cells+by+Epstein-Barr+virus.">B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 801-812 (2003).</li><li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells:+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus.">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat. 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利害の衝突は宣言されません。

このホワイトペーパーで説明する方法では、急速な不死化および凍結保存の時間を持つドナー末梢血からLCLを生成します。 FK506、免疫抑制性T細胞、および感染性ウイルスの高力価を使用することで我々は、末梢血単核細胞からのE​​BV感染B細胞の増殖を促進することができます。これらの介入は、その後の実験のための細胞の急速な拡大の結果、記載された方法がより効率的になる。 伝統的に、成長の変換はEBV 6,15への曝露後約一週間、光学顕微鏡で細胞のクラスターの可視化によって監視されています。しかし、セルのクラスタリングは、EBV -介した増殖形質転換の具体的な指標ではありません。我々は以前に後方三日には早くも成功を決定するために、正確かつ具体的な方法を提供する、フローサイトメトリー14を介して増殖する細胞集団の一貫性の識別を示しているEBVのB細胞の小胞体への暴露。

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>アムホテリシンB </td><td>フィッシャーBioreagents </td><td> BP 928から250 </td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td><td>シグマ</td><td> D 2650 </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、熱不活化</td><td>シグマ</td><td> F 4135 </td></tr><tr><td>フィコールハイパックリンパ球の分離媒体</td><td> Mediatech </td><td> 25から072 </td></tr><tr><td>タクロリムス</td><td> AG科学</td><td> F 1030 </td></tr><tr><td>マウス血清からのIgG </td><td>シグマ</td><td>私8765 </td></tr><tr><td> PEに結合したマウス抗ヒトCD23 </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 555711 </td></tr><tr><td> PEに結合したマウスアイソタイプIgG1の</td><td> BD Pharmingen社</td><td> 554680 </td></tr><tr><td> FITCに結合したマウス抗ヒトCD58 </td><td>ピアースサーモScはientific </td><td> MA1 - 82159 </td></tr><tr><td> FITCに結合したマウスアイソタイプIgG1の</td><td> BD Pharmingen社</td><td> 550616 </td></tr><tr><td> PE - Cy5標識に結合したマウス抗ヒトCD19 </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 555414 </td></tr><tr><td> PE - Cy5標識に結合したマウスアイソタイプIgG1の</td><td> Dako社製</td><td> X 0955 </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> RPMI 1640培地</td><td>シグマ</td><td> R 8758 </td></tr><tr><td>テトラデカノイルホルボールアセテート（TPA） </td><td>カルビオケム</td><td> 407952 </td></tr><tr><td> FACSバッファー（1Xのリン酸緩衝生理食塩水+ 5％ウシ胎児血清）を</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of epstein-barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines

Epstein - Barrウイルス（EBV）によるB細胞の感染は、in vitroでのリンパ芽球様細胞株（LCL）の設立で、その結果、増殖とその後の不死化につながる。 LCLが潜在EBVに感染しているので、彼らは、EBVの潜伏とウイルス駆動型B細胞の増殖と腫瘍形成1を調査するモデルシステムを提供しています。 LCLは、免疫学的ア ​​ッセイ2、3の様々な抗原を提示するために使用されている。さらに、LCLは、ヒトモノクローナル抗体4、5を生成し、主要な生物学的物質へのアクセスが6,7に限定されて潜在的に無限のソースを提供するために使用することができます。 様々な方法は、LCLを生成するように記載されている。以前の方法には、フィトヘマグルチニン、リポ多糖8などのマイトジェンの使用を含め、およびEBV -介した不死化の効率を高めるためにマイトジェン9ヨウシュヤマゴボウている。最近では、他の人はimmunosupprを使用しているこのようなT細胞媒介性感染B細胞7、10-12の殺害を阻害するためシクロスポリンのような様格剤。 EBV感染から細胞株の確立までの時間のかなりの長さは、EBV駆動型のB細胞増殖の変換のためのより速く、より信頼性の高い方法の必要性を駆動する。高力価EBVと免疫抑制剤の組み合わせを使用して、我々は一貫して、感染、変換、および末梢血のB細胞からLCLを生成することができます。この方法は、細胞のin vitroでのクラスタに感染している末梢血単核細胞の少量を実証することができます使用しています。 FK506、免疫抑制性T細胞の存在下でEBVとCD23の存在。伝統的に、増殖B細胞の伸長は、EBV感染後約一週間の細胞の顕微鏡クラスターの視覚化によって監視されます。 LCLの塊は、数週間後に肉眼で見ることができます。我々は、EBV -介したグラムであれば早期に決定するアッセイを説明rowth変換は、細胞の顕微鏡クラスターを示すことができる前であっても成功しています。 CD23の存在ハイテク CD58 +細胞は、3日後に感染が成功した結果を示すように早期に観察された。

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Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

我々は、EBウイルスを用いて形質転換B細胞株を生成する方法を説明します。我々はまた、感染3日後には早くも変換を受けることを運命づけB細胞を識別することができる新たなアッセイを示しています。

Epstein - Barrウイルスの成長形質転換リンパ芽球様細胞株の樹立

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

establishment-epstein-barr-virus-growth-transformed-lymphoblastoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.8K ビュー.  State University of New York at Stony Brook. 我々は、EBウイルスを用いて形質転換B細胞株を生成する方法を説明します。我々はまた、感染3日後には早くも変換を受けることを運命づけB細胞を識別することができる新たなアッセイを示しています。

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Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified mice, such as Atm-/- and p53-/- consistently develop thymic lymphoma early in life 1,2, and thus, can serve as a reliable source for derivation of murine T-cell lines. Here we present a detailed protocol for the development of established murine thymic lymphoma T-cell lines without the need to add interleukins as described in previous protocols 1,3. Tumors were harvested from mice aged three to six months, at the earliest indication of visible tumors based on the observation of hunched posture, labored breathing, poor grooming and wasting in a susceptible strain 1,4. We have successfully established several T-cell lines using this protocol and inbred strains ofAtm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 and p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5 mice. We further demonstrate that more than 90% of the established T-cell population expresses CD3, CD4 and CD8. Consistent with stably established cell lines, the T-cells generated by using the present protocol have been passaged for over a year.

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

In this video we demonstrate a protocol to establish mouse thymic lymphoma cell lines. By following this protocol, we have successfully established several T-cell lines from Atm-/- and p53-/- mice with thymic lymphoma.

から胸腺リンパ腫のT細胞株の導出 ATM - / -</supと p53の - / -</supマウス

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

免疫・感染学

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

臍帯血から細胞傷害性Tリンパ球の拡大をそのターゲットサイトメガロウイルス、エプスタイン - バーウイルス、およびアデノウイルス

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Alphaherpesウイルス順行性輸送とスプレッドの生細胞イメージング

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

Bリンパ芽球様細胞株の樹立のためのシンプルな赤血球溶解法

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

NK と慢性的なアクティブなエプスタイン ‐ バーウイルス感染症から T 細胞株を確立する効率的かつ簡単な方法

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

全血豚で表されるコーディングおよび非コーディングの RNA クラスの識別

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

ウイルス感染とキイロショウジョウバエのホスト ウイルスの相互作用の解析

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

狂犬病ワクチンの効力を評価するインビトロELISA試験

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...