このプロトコルは、フローサイトメトリーのソーティングパラメータを最適化することにより、小さな細胞外小胞に対する迅速かつサイズ固有のソリューションメソッドを提供します。これらの最適化は、前方散乱対サイズ散乱のみを使用して小さな細胞外小胞の代表的な集団を取得できるようにする重要なソート設定のパネルを提供します。フローセルソーターの標準的な起動手順を実行することから始めます。
起動ボタンを押してマシンの電源を入れ、レーザーコントロールパネルのレーザーパワーボタンをクリックします。スマートサンプラーサブメニューのタンク交換ボタンを押して、流路系を加圧します。超音波洗浄された50マイクロメートルのジェットとエアノズルを使用し、ノズルアセンブリに取り付けます。
圧力コンソールで、シース液の場合は80 SI、サンプルフローの場合は80.3 SIに圧力を調整します。シース流開始ボタンを押して、シース流の流れを開始します。スマートサンプラーサブメニューのバブルボタンをクリックすると、自動的に 10 分間デバブルしてからオフにします。
流れを整列させてレーザースポットを決定するには、照明チャンバーライトをオンにして、ピンホール上の流れを表示します。上下、左右、前後のマイクロメータを調整して、ストリームをピンホールの中央に配置し、ストリームに焦点を合わせます。すべてのレーザーシャッターを開き、レーザーとストリームインターセプトタブを選択し、プロンプトに従って緑色の矢印ボタンを押し続けて、レーザーインターセプトとノズルアライメントのキャリブレーションプロセスを完了します。
ファインレーザーアライメントスクリーンにアクセスします。x軸パラメータとして640ナノメートルレーザーと772バール44バンドパスチャネルを選択し、y軸パラメータとして405ナノメートルレーザーと448バー59バンドパスチャンネルを選択します。トリガーパラメータセレクターを押して、488ナノメートルレーザーの前方散乱パラメータを選択します。
次に、1ミリリットルの二重蒸留水に1滴を加えてレインボー蛍光粒子を1ミリリットルあたり10〜6個のビーズの1倍の最終濃度になるように希釈する。サンプルチャンバーのドアを開き、準備されたレインボー蛍光粒子のチューブをロードします。サンプル開始ボタンを押し、マイクロメータを上下に調整して蛍光強度を最適化し、各信号を可能な限り強くします。
タッチスクリーンコントロールパネルの品質管理開始ボタンまたはQCボタンを押して、QCを自動的に実行します。次に、IntelliSort 初期化ボタンを押します。液滴振動の周波数と振幅を自動的に調整し、約25の液滴遅延を実現し、液滴のブレークオフポイントを鮮明に視覚化することができます。
次に、ドロップ遅延ボタンとメンテナンスボタンを押します。ソート出力タイプとしてチューブを選択します。15ミリリットルのチューブホルダーをソートチャンバーに入れます。
プレート電圧をオンにし、プレート電圧を約4, 000ボルトに設定します。次に、ストリーム設定ボタンを選択してテストパターンをオンにします。充電位相スライダーと偏向スライダーを調整して、ストリームの画像が収集チューブと一致していることを確認します。
次に、チェック マーク ボタンを選択します。コンピュータでSummitワークステーションにログインします。ファイルのメインメニューから新しいプロトコルを作成します。
次に、Summit Softwareコントロールパネルのヒストグラムタブを選択してドットプロットを作成します。X 軸パラメータとして前方散布図を選択し、Y 軸パラメータとして側面散布図を選択します。次に、ワークスペースで新しいドットプロットの軸を右クリックし、前方散布図と側方散布図を対数形式で表示します。
[集録]タブを選択し、集録パラメータパネルを見つけます。パラメータを有効にするサブメニューですべての信号を有効にします。トリガー パラメーターとして前方散布を選択し、しきい値を 0.01 に設定します。
前方散乱と側方散乱の電圧とゲインを250と0.6に調整して、前方散布図と側方散布図内のイベントと母集団が分離されるようにします。蛍光ポリスチレンミクロスフェアを1ミリリットルの二重蒸留水に1マイクロリットルのミクロスフェアを加えて、100、200、および300ナノメートルの懸濁液に希釈します。次に、マイクロスフェアサスペンションを連続してロードします。
Summit Software の取得メニューで [開始] を選択して 20 、 000 件のイベントを記録し、イベントの記録後に [停止] をクリックします。前方散布図と側方散布図のドットプロットを右クリックして長方形を作成し、ドラッグしてサイズを変更します。電子ノイズと100ナノメートルの微小球集団の領域を右クリックして、それぞれR7とR4の名前に変更して、領域を再配置します。
手順を繰り返して、200ナノメートルと300ナノメートルのミクロスフェアを長方形で連続してフレーム化し、それぞれR5とR6に変更します。最後に、電子ノイズと200ナノメートルの粒子の位置に基づいて50〜200ナノメートルの選別領域を決定し、R8として定義します。ソートロジックと統計パネルでソート決定を編集するには、左側のストリームまたはL1ストリームの空白フィールドをダブルクリックし、R8という名前のリージョンを選択してソートロジックを作成します。純度の中止モードを選択し、L1ストリームの1滴より上の液滴エンベロープを選択します。
事前に調製した細胞外小胞またはEV混合物の500マイクロリットルのサンプルをロードします。Summit の集録メニューの下にある [スタート] ボタンを押してデータを取得し、[停止] をクリックします。次に、ソートメニューの[開始]を押して、50〜200ナノメートルサイズの小さな細胞外小胞またはsEVを15ミリリットルの遠沈管に収集します。
標準サイズのポリスチレンミクロスフェアのフローサイトメトリー分析により、前方散乱対側散乱プロットで50〜200ナノメートルのサイズ範囲を特定すると、識別可能な粒子信号が明らかになりました。R4、R5、およびR6は、それぞれ100、200、および300ナノメートルの粒子の位置を指します。R7は50ナノメートルの粒子に対する検出限界としての電子雑音であり、R8は50〜200ナノメートルの粒子の位置範囲を表す。
ナノ粒子追跡分析(NTA)による膵臓1細胞由来のEVs混合物の粒度分布は、超遠心後40〜400ナノメートルの広い範囲にあった。フローサイトメトリーソーティングを実施して、R8領域内の50〜200ナノメートルのsEVを単離および精製しました。分離の品質はNTAによって検証され、選別後のsEVの粒径範囲は50〜200ナノメートルであることがわかりました。
さらにTEMによりsEVの存在を観察し、単離したsEVにはウェスタンブロット分析によりCD6、CD63、およびCD81のマーカーが含まれていることを確認しました。この方法は、小さな細胞外小胞の分離と、小さな細胞外小胞の遺伝子発現の分類またはタンパク質分析を可能にし、多くの下流の研究アプリケーションを開きます。
