このレポートに記載されている方法は、健康状態および疾患状態における自発的排尿の生理学的および神経行動的側面を理解するために使用できます。この手法により、その日の明るい段階と暗い段階でマウスのボリュームの動作を監視でき、排尿イベントに関する時間的、空間的、および体積情報が提供されます。リアルタイムボイドスポットアッセイまたはRT-VSA記録チャンバーを調製するには、時間帯に応じて、RT-VSA記録ケージの下部に薄いまたは厚いろ紙を置きます。
ろ紙の上に、睡眠スペース用のプラスチック製イグルー、濃縮用の滅菌済み1.5 mlマイクロ遠心チューブ、および2〜3個のマウスドライチャウを含む60 mm x 15 mmのプラスチック皿、およびゲルパックの形の14〜16グラムの水。記録チャンバーの準備ができたら、マウスをろ紙にそっと置きます。ハウジングケージから記録ケージへのマウスの移動が最小限のストレスで行われることを確認してください。
マウスが記録ケージに入ったら、蓋を置き、蓋の上部を吸収性ベンチの青いパッドで覆い、プレキシガラスの蓋の表面への直接の周囲光の反射を最小限に抑えます。下部チャンバーの紫外線をオンにします。上部と下部のカメラからRT-VSAビデオを録画するには、複数のWebカメラまたはネットワークカメラから同時に録画するように構成されたビデオ監視録画ソフトウェアを使用します。
を押して録音を開始します Cmd R プログラムウィンドウで。毎秒1フレームでビデオ録画を実行します。録音を開始した直後に、部屋を出てドアをそっと閉めます。
実験全体を通して部屋が静かに保たれていることを確認してください。を押して録音を停止します Cmd T.紫外線をオフにします。録画を停止すると、カメラごとにm4v形式のムービーファイルが自動的に生成され、以前に選択した保存先フォルダーにカメラの名前で保存されます。
各カメラのフォルダー内で、実験が日付別にフォルダーに整理されていることを確認します。各日付または実験フォルダーに、1 つの m4v ファイルと、各ムービー フレームに対応する個々の jpeg ファイルがすべてあることを確認します。実験の名前と日付を含むフォルダーをデスクトップに作成し、m4v ファイルをこのフォルダーに転送します。
ムービーフォルダをフラッシュドライブにコピーして、外部コンピュータで分析します。下のカメラが明期に収集したムービーファイル、または上側のカメラが暗期に収集したムービーファイルを解析用に開きます。ムービーの品質を評価した後、早送りコマンドまたはタイムバースライダーを使用して正しいタイムウィンドウに移動して実験を分析します。
明期中の排尿活動は、午前11:00から午後5:00の間に記録され、暗期には深夜から午前6:00まで記録されます。早送りアイコンをクリックして早送りモードでムービーを再生するか、手動でムービーをスクロールして、マウスが無効になっている証拠を探します。ろ紙に明るい尿の斑点が突然現れるか、ケージの角への移動やマウスが排尿しているときの短時間の非活動など、行動の変化を探します。各ボイドが発生する時刻を登録します。
慣例として、排尿の時間は尿が検出された最初の兆候で記録されます。ボイドの測定を行うには、最初にスクロールバーを使用して時間を前後に移動し、尿スポットの最大拡散が発生したポイントを探します。この時点でムービーを一時停止し、分析中の場所にコンピューターのマウス矢印を置いて、スクリーンショットの関心のあるスポットをマークします。
スクリーンショットファイルには、ムービーに表示される順序を考慮して相関番号を使用して名前を付けます。すべてのボイドスポットを分析したら、スクリーンショットをキャプチャし、ろ紙の境界を描いて、ろ紙の総面積を測定します。各尿スポットのパーセンテージ面積を計算します。
グラフ作成ソフトウェアの検量線と補間機能を使用して、パーセンテージ領域の値を各ボイドスポットの尿量に変換します。雌および雄のPiezo1、2、ノックアウトおよび対照マウスの排尿行動を、その日の暗期および明期に記録した。それらの不活性な明期の間、対照と比較して、雌または雄のノックアウトマウスについて分析されたいずれのパラメータにおいても有意差は観察されなかった。
しかしながら、活動的な暗期において、雌および雄のノックアウトマウスは、小さな空隙スポットの数および総体積の有意な増加を特徴とする、変化した排尿表現型を示した。対照マウスと比較して、雌または雄のノックアウトマウスにおいて、一次ボイドスポットまたはPVS数、PVS当たりの平均体積、または総PVS体積に有意差はなかった。雌マウスの排尿行動を、基礎条件下でシクロホスファミド処理後に試験した。
基礎条件と比較して、シクロホスファミド治療後の空隙あたりの尿放出量は少なく、排尿イベントははるかに頻繁です。アッセイの再現性を高めるための重要な側面の1つは、動物をできるだけ穏やかに操作し、試験期間全体を通して最小限のストレス下に保つことです。これは非侵襲的なアッセイであるため、膀胱括約筋と外尿道括約筋機能をそれぞれ評価するために、サイトメトリーと筋電図検査を含む追加の手順を後で実行できます。
この手法を実装することで、研究者は健康状態や病状における排尿行動に対する特定の経路の寄与を定義することができます。
