이 보고서에 설명된 방법은 건강 및 질병 상태에서 자발적인 배뇨의 생리학적 및 신경 행동적 측면을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 하루의 밝은 단계와 어두운 단계에서 마우스 볼륨 동작을 모니터링할 수 있으며 보이드 이벤트에 대한 시간적, 공간적, 체적 정보를 제공할 수 있습니다. 실시간 보이드 스폿 분석 또는 RT-VSA 기록 챔버를 준비하려면 RT-VSA 기록 케이지 바닥에 시간에 따라 얇거나 두꺼운 여과지를 놓습니다.
여과지 위에 수면 공간을위한 플라스틱 이글루, 농축 용 멸균 1.5ml 미세 원심 분리기 튜브, 60mm x 15mm 플라스틱 접시에 마우스 건조 차우 2-3 개, 젤 팩 형태의 물 14-16g을 놓습니다. 녹음 챔버가 준비되면 마우스를 여과지 위에 부드럽게 놓습니다. 하우징 케이지에서 기록 케이지로 마우스를 옮길 때 최소한의 스트레스로 발생하는지 확인하십시오.
마우스가 녹화 케이지 안에 들어가면 덮개를 놓고 덮개 상단을 흡수성 벤치 파란색 패드로 덮어 플렉시 유리 덮개 표면에 직접적인 주변광 반사를 최소화합니다. 하부 챔버의 자외선을 켭니다. 상단 및 하단 카메라에서 RT-VSA 비디오를 녹화하려면 여러 웹캠 또는 네트워크 카메라에서 동시에 녹화하도록 구성된 비디오 감시 녹화 소프트웨어를 사용하십시오.
프로그램 창에서 Cmd R을 눌러 녹음을 시작합니다. 초당 한 프레임으로 비디오 녹화를 수행합니다. 녹음을 시작한 직후 방을 나와 문을 부드럽게 닫습니다.
전체 실험 동안 방이 조용하게 유지되는지 확인하십시오. Cmd T를 눌러 녹음을 중지하고 자외선을 끕니다. 녹화를 중지한 후 소프트웨어는 각 카메라에 대해 m4v 형식의 동영상 파일을 자동으로 생성하고 이전에 선택한 대상 폴더에 카메라 이름으로 저장합니다.
각 카메라의 폴더 내에서 실험이 날짜별로 폴더로 구성되어 있는지 확인합니다. 각 날짜 또는 실험 폴더에 하나의 m4v 파일과 각 동영상 프레임에 해당하는 모든 개별 jpeg 파일이 있는지 확인합니다. 실험 이름과 날짜가 적힌 폴더를 바탕 화면에 만들고 m4v 파일을 이 폴더로 전송합니다.
외부 컴퓨터에서 분석하기 위해 동영상 폴더를 플래시 드라이브에 복사합니다. 분석을 위해 밝은 단계 동안 하단 카메라 또는 어두운 단계 동안 상단 카메라에서 수집한 동영상 파일을 엽니다. 동영상의 품질을 평가한 후 빨리 감기 명령 또는 시간 표시줄 슬라이더를 사용하여 올바른 시간 창으로 이동하여 실험을 분석합니다.
밝은 단계 동안의 배뇨 활동은 오전 11:00에서 오후 5:00 사이, 어두운 단계에서는 자정에서 오전 6:00 사이에 기록됩니다. 빨리 감기 아이콘을 클릭하여 빨리 감기 모드에서 동영상을 재생하거나 수동으로 동영상을 스크롤하여 마우스가 무효화되고 있다는 증거를 찾습니다. 여과지에 갑자기 밝은 소변 반점이 나타나거나 케이지 모서리로의 움직임과 마우스가 배뇨 할 때 잠시 동안 활동하지 않는 것을 포함한 행동 변화를 찾으십시오. 각 보이드가 발생하는 시간을 등록합니다.
관례로, 공극의 시간은 소변이 검출되는 첫 번째 징후에 기록됩니다. 공극을 측정하려면 먼저 스크롤 막대를 사용하여 시간을 앞뒤로 이동하여 소변 반점이 최대한 확산된 지점을 찾습니다. 이 시점에서 동영상을 일시 중지하고 컴퓨터 마우스 화살표를 분석 중인 지점에 배치하여 스크린샷에 관심 지점을 표시합니다.
동영상의 출현 순서를 설명하기 위해 상관 번호를 사용하여 스크린샷 파일의 이름을 지정합니다. 모든 보이드 스폿이 분석되면 스크린샷을 캡처하고 여과지의 테두리를 그려 여과지의 전체 면적을 측정합니다. 각 소변 반점의 백분율 면적을 계산하십시오.
백분율 영역의 값을 그래프 소프트웨어의 교정 곡선 및 보간 기능을 사용하여 각 공극 지점에 대한 소변의 양으로 변환합니다. 암컷 및 수컷 Piezo1, 2, 녹아웃 및 대조군 마우스의 배뇨 행동은 낮의 어둡고 밝은 단계에서 기록되었습니다. 비활성 광 단계 동안, 대조군과 비교하여 암컷 또는 수컷 녹아웃 마우스에 대해 분석된 임의의 매개변수에서 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다.
그러나, 활동적인 암흑기에서, 암컷 및 수컷 녹아웃 마우스는 작은 공극 반점의 수 및 총 부피의 현저한 증가를 특징으로 하는 변화된 배뇨 표현형을 나타내었다. 대조군 마우스와 비교하여 암컷 또는 수컷 녹아웃 마우스에서 1차 공극 반점 또는 PVS 수, PVS당 평균 부피 또는 총 PVS 부피에 유의한 차이가 없었습니다. 암컷 마우스의 배뇨 거동은 기저 조건 하에서 그리고 시클로포스파미드 처리 후에 시험하였다.
기저 조건에 비해 시클로포스파미드 치료 후 공극당 소변 방출량이 더 적고 배뇨 사건이 훨씬 더 빈번합니다. 분석 재현성의 한 가지 핵심 측면은 동물을 가능한 한 부드럽게 조작하고 전체 테스트 기간 동안 최소한의 스트레스 상태로 유지하는 것입니다. 이것은 비침습적 분석이기 때문에 방광 및 외부 요도 괄약근 기능을 각각 평가하기 위해 세포 분석 및 근전도 검사를 포함한 추가 절차를 나중에 수행할 수 있습니다.
이 기술을 구현하면 연구자가 건강 및 질병 상태에서 행동을 무효화하는 특정 경로의 기여도를 정의할 수 있습니다.
