このプロトコルは、分子の可能性と従来の活性を評価するためのハイスループットスクリーニングアッセイで使用できる菌株を生成するための鍵となります。 手順を実証するのは、私の研究室の研究助手であるフアナ・キンテロとローラ・ピネダです。まず、コード配列を保存するために、忠実度の高いポリメラーゼを使用して標的遺伝子を増幅します。プライマーを最終濃度0.2マイクロモルの反応ミックスに加え、原稿に記載されているPCRサイクリングプロトコルを実行します。
増幅されたPCR断片を通常のPCR産物精製キットを用いて精製する。eGFP PCR産物の末端をトリミングするには、製造元の指示に従ってKpn I酵素との反応を設定し、摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、100ミリモルの塩化ナトリウムと10単位のBgl IIを反応物に加え、15分間インキュベートします。
消化後、前に示したように反応を精製します。次に、pLEXSY発現ベクターをBgl IIおよびKpl Iで消化し、先に実証したように逐次消化を行う。100ナノグラムの消化されたpLEXSYベクターと28ナノグラムの消化されたeGFPを、リガーゼバッファーと3ユニットのT4 DNAリガーゼを含む20マイクロリットルの反応でリゲートします。
摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーションの最後に、標準的な形質転換プロトコルを使用して、コンピテント大腸菌細胞をライゲーション産物で形質転換します。形質転換細胞をLBアンピシリン寒天培地にプレートし、摂氏30度で24時間インキュベートして組換えクローンを選択します。
コロニーをスクリーニングした後、市販のプラスミド単離キットを使用して、その後のトランスフェクションのために陽性クローンからプラスミドDNAを精製します。プラスミドの線状化断片を生成するには、精製されたpLEXSY eGFPプラスミドを少なくとも10マイクログラム取り、摂氏25度で3〜4時間SWA1で消化します。インキュベーションの終わりに、消化生成物を摂氏65度で20分間熱失活します。
次に、消化産物をアガロースゲル電気泳動で実行し、得られた断片を分離します。市販のアガロースゲル抽出キットを使用して、製造元の指示に従って発現カセットを精製します。十分な対数期または初期の静止期前鞭毛虫ができるまで寄生虫培養物を増殖させる。
必要に応じて、複数の培養フラスコの内容物をプールします。寄生虫培養物を2, 000 Gで室温で3分間遠心分離する。ペレットを摂氏4度のエレクトロポレーションバッファーに再懸濁して、1ミリリットルあたり10〜8分の1の濃度になり、氷上で10分間保持します。
同時に、50マイクロリットルの水またはpH 8.0の10ミリモルトリスバッファーおよび直径2ミリメートルのエレクトロポレーションキュベット中に2〜10マイクログラムの直鎖状pLEXSY eGFPコンストラクトを含むプレチルチューブ。次に、350マイクロリットルのプレチルド寄生虫を線状プラスミドとともにチューブに加え、400マイクロリットル全体を氷上のエレクトロポレーションキュベットに移します。寄生虫細胞をプラスミドでエレクトロポレートし、並行してプラスミドDNAを含まない寄生虫細胞をネガティブコントロールとして電気培養します。
キュベットを氷の上に10分間置きます。エレクトロポレーションした寄生虫を5ミリリットルの適切な培地に移し、摂氏26度で20時間インキュベートします。エレクトロポレーションの約20時間後に、培養物を顕微鏡で観察し、使用するpLEXSYプラスミドに応じて適切な選択的抗生物質を添加します。
プラスミドDNAの有無にかかわらずエレクトロポレーションした寄生虫の間に明確な違いがあるまで、培養物を顕微鏡で追跡します。フローサイトメトリーで寄生虫の蛍光を確認するには、1ミリリットルの固定相培養物を2, 000 Gで室温で3分間遠心分離します。細胞をPBSで2回洗浄した後、最終ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁する。
サンプルを実行し、毎秒0.5マイクロリットルの速度で20, 000のイベントを収集します。前方散乱、側方散乱、蛍光 1 チャンネルのゲイン値をそれぞれ 225.0、200.0、520.0 に設定します。寄生虫集団を含むゲートG1を作成します。
そのゲートを通してFL1チャネルをフィルタリングして、プロマスティゴテスの自家蛍光を決定し、FL1チャネルの範囲ゲートG2を設定します。トランスフェクトした寄生虫を実行して、蛍光があるかどうかを確認します。G1の蛍光性寄生虫の割合とG2の蛍光強度の平均を記録します。2〜5ミリリットルの固定期寄生虫培養物から、従来のフェノールクロロホルム抽出または市販のキットを使用してゲノムDNAを精製します。
pLEXSY-sat2.1の診断PCRは、原稿に記載されているサイクリングプロトコルを使用して実行します。フローサイトメトリーで蛍光を確認した後、組換え寄生虫の希釈液を1ミリリットルあたり5個のプロマスティゴテスの濃度で調製します。この希釈液100マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに加え、プレートを少なくとも12時間そのままにします。
寄生虫増殖を伴うウェルが検出されるまで、最小倍率100倍でプレートを顕微鏡で追跡します。井戸が寄生虫でいっぱいになったら、その内容物を使って5ミリリットルの培養物を接種します。クローン播種培養物が固定期に達したら、前述のようにフローサイトメトリーを使用して蛍光を検証します。
98%から99%の蛍光寄生虫と、in vitroおよびin vivoアッセイの最大平均蛍光強度を持つクローンを選択します。pLEXSY eGFPコンストラクトで形質転換した大腸菌細胞のコロニーPCRにより、859塩基対産物が生成された。SWA1を用いたプラスミドの全消化により、大腸菌での複製と選択に必要なすべての要素を含む2.9キロ塩基対フラグメントと、トランスフェクションに使用される直鎖化発現カセットを表す7〜8キロ塩基対フラグメントの2つのフラグメントが得られました。
フローサイトメトリー解析により、トランスフェクトされたL.panamensis寄生虫の82%がeGFPを発現していることが明らかになりました。ポリクローナル選択後、フローサイトメトリーで分析されたL.donovani寄生虫の98.44%は、L.panamensisの82.0%と比較して蛍光性でした。pLEXSY eGFPのSSU遺伝子座への組み込みに成功し、診断用PCRにおいて2.3キロ塩基ペアの産物が得られました。
蛍光寄生虫の割合が最も高いクローンおよび平均蛍光強度を有するクローンを、薬物スクリーニングアッセイにおけるさらなる使用のために選択した。この方法は、組換えリーシュマニア寄生虫の生産を可能にする
