Name: generation of fluorescent protein fusions in candida species
Uploaded: 2017-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species at JoVE.com

私たちは、元のmCherryをFPシーケンスを提供するためのN.ディーンに感謝、M. Gerami-Nejadプラスミドの構築のために、このプロジェクトの開発中に有益な助言のための技術支援のためのB.ラーソン、およびT. Heisel。 JBは、欧州研究評議会上級賞340087（RAPLODAPT）によってサポートされていました。顕微鏡およびイメージングシステムは、ミネソタ小児科財団の大学とミネソタイメージングセンターの大学によって提供されました。

大腸菌から1アイソテンプレートプラスミド<ol><li>振盪しながら37℃で10 mlのLB培地（LB）+ 200 mg / Lのアンピシリン（AMP）で一晩鋳型プラスミドを含む大腸菌を成長させます。 </li><li> 2分間6000×gで遠心分離によって細胞を回収します。 </li><li>液体をデカントし、のAusubelに前述したようにらの標準的な方法により、 大腸菌細胞からDNAを単離および精製します。 8。 </li><li>トリスEDTA中で再懸濁したDNA（TE、10mMトリス、pH8.0の、1mMのEDTA、pH8.0）で50〜100 ng / mlでの作業濃度で。 </li></ol> 2.デザインプライマー<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="0.5in" style="width:50px"> プライマー </td><td> プライマー配列 </td></tr><tr><td> F1 </td><td> 5 &#39; <strong&gt; GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTTCTAAAGGTGAAGAATTATT 3 &#39; </td></tr><tr><td> R1 </td><td> 5 &#39;GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> F2 </td><td> 5 &#39;GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 &#39; </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 5 &#39;GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 &#39; </td></tr></tbody></table> 表1：本研究で用いたプライマー配列。太字イタリック体のテキストは、通常のフォント領域はプラスミドDNAに相同である、ENO1ゲノム遺伝子座と相同性を示しています。 <ol> &lt;李&gt;デザインプライマーは、遺伝子のゲノム遺伝子座への組換えを容易にするために、目的の標的遺伝子の3 &#39;末端（ 例えば ENO1）に同様に増幅されるカセットに隣接する配列をプラスミドに相同であることにする（ 図2、 表1） 。 <ol><li>なるように符号化フレームに加え、プラスミド配列の最初の約30塩基対を維持するために、フォワードプライマーの配列は、最後の目的の遺伝子の70塩基対（bp）、5&#39;-3 &#39;、マイナス停止コドンと一致していることを確認増幅されました。注意点としては、各プライマーでGGTGGTGGTTなしFP相同性を有するポリグリシンリンカーです。注目すべきは、リンカーの非存在下では、理論的には、タンパク質ミスフォールディング、タンパク質産生の低い収率、又は障害の生物活性をもたらすことができ、機能的ドメインの直接的な融合が存在することができます。 </li><li>リバースプライマー配列は、遺伝子の70 bpのすぐ下流にあることを確認してください3 &#39;、5&#39;、任意の遺伝子配列に加え、最後のアプロを含みませんximatelyプラスミドで使用される栄養または薬剤耐性マーカーの30bpの。 </li><li>利用F1およびR1はpMG2343でmCherry- NAT1を生成するpMG2120とpMG2263、それぞれとF2とR2とのGFP-NAT1とYFP- NAT1カセットを生成します。 </li></ol></li></ol> 3. PCRによりFPカセットを生成します（1日目） <ol><li> PCR用試薬を準備します。 1.5ミリリットルチューブに以下の体積および濃度を追加することによって、マスターミックス（500μlの最終容量）を行います。50μlのPCR緩衝液（500mMの塩化カリウム、水中の100 mMトリスpHは8.0）、20μlのデオキシヌクレオチド（dNTP類;原料混合物各10mMのヌクレオチド）、40μlの25 mMの〜50-100 ngの/μlのストック溶液から塩化マグネシウム、20μlの精製されたプラスミド（）、10μlの各フォワードのと、（）10mMストック溶液から30μlのTaqポリメラーゼを逆方向プライマーポリメラーゼ（ジェネリック、5000単位/ ml）、および320μlの水。 <ol><li> 10 PCR-の互換性がのそれぞれにマスターミックスのアリコート50μlのル0.5ミリリットルチューブ。 </li></ol></li><li>次の手順をサーモサイクラーにPCRチューブを配置し、実行：1サイクル分5を94℃で二本鎖DNAを変性させ; 94℃で45秒の40サイクルを順次、55℃で30秒のプライマーは、プラスミド鋳型DNAにアニールすることを可能にし、DNA産物の伸長のために68℃で4分間します。 72℃で15分の1の最終伸長サイクル。 注：PCRマスターミックス、サイクリングパラメータは、使用される特定のTaqポリメラーゼに基づいて変更する必要があります。 </li><li>プール1.5mlチューブ内の10のPCR反応からのすべての製品。 <ol><li>アガロースゲル電気泳動にプールされたPCR産物の主題5μlのDNAラダーとの比較に基づいて、アンプリコンのサイズを確認し、生成物濃​​度の推定値を得ます。一般的に、後続の各形質転換混合物にカセットDNAの〜250μgのを使用します。 </li><li>生成物を750μlの95％エタノール、続いて50μlの3M酢酸ナトリウムを添加することによってDNAを沈殿させ、少なくとも30分間インキュベート-20℃で</li><li> 10分間16,000×gでチューブを遠心分離することにより、PCR産物を収穫。慎重に除去し、上清を捨て、一晩ペレットを乾燥させます。 40μlのTE pH8.0の中で乾燥させたDNAカセットペレットを再懸濁し、使用するまで室温で保管してください。 </li></ol></li></ol> 4. FP DNAカセットでカンジダ細胞を形質転換<ol><li> 1日目に、いくつかのストリーキングによって凍結15％グリセロール（-80°C）在庫から変換される回復する酵母株はアデニン（YPAD）寒天で酵母ペプトンデキストロース上に結晶を掻き取り、30℃でインキュベートします。コロニー増殖の回復後、通気キャップを有するガラス培養管2mlの液体YPAD培地に単一コロニーを接種し、攪拌しながら30℃で一晩インキュベートします。 </li><li> 2日目、通気性キャップと125ミリリットルの三角フラスコに（0.2〜の最終OD 600）新鮮なYPAD 50ミリリットルに一晩の酵母培養物の300μlの希釈します。 30℃で振ります（最終OD 600〜0.6から0.8へ）〜3時間。 <ol><li> 50ミリリットルコニカルチューブに一晩培養物を注ぎ、テーブルトップ遠心機で1 500×gで5分間回転させることによって細胞をペレット化。 </li><li>捨て、適切に上清を捨てます。 5ミリリットルの水で細胞ペレットを再懸濁します。テーブルトップ遠心機で1,500×gで5分間再度遠心分離して細胞を再ことペレット。 </li><li>捨て、適切に上清を捨てます。 1.5mlチューブに転送中：500μlのTELiAc（10 mMトリス、pH8.0,1mMのEDTA、pHが8.0、0.1 M酢酸リチウムTEの酢酸リチウム）で細胞を再懸濁します。微量で3000×gで2分間遠心操作を。 </li><li> 250μlのTELiAcで細胞を再懸濁し。ペレットを含む総体積は〜300μlのでなければなりません。 </li></ol></li><li>クリーン（4.2.4とは異なるマイクロチューブ）に、5μlのキャリアDNA（10mg / ml）および（4.2.4）から調製したカンジダ細胞の150μlのを追加します。これは、トンの陰性対照でありますransformation。 <ol><li>第二の清浄なマイクロチューブに、変性キャリアDNA5μlの（すなわち、10分間90℃で煮沸し、4℃に冷却されている）、（3.3.1）から調製されたPCR産物の全てを40μlおよび150を追加（4.2.4）から調製したカンジダ細胞 μlの。 </li><li>室温で30分のための2つの形質転換混合物をインキュベートします。 </li><li>各形質転換混合管に、700μlのプレートミックス（10mMのトリス、pH8.0の、1mMのEDTA、pH8.0の、50％のポリエチレングリコール3350 0.1 M酢酸リチウム）を加えます。 RTで一晩、それらを混合し、インキュベートするチューブを反転。 </li></ol></li><li> 3日目に、変換は1時間42°C（ヒートショック）でミックスインキュベートします。 <ol><li>遠心分離機変換は微量で16,000×gで30秒間混合します。削除し、適切に上清を捨てます。細胞に損傷を与えないようにダウンして静かにピペッティングにより150μlの水で細胞ペレットのそれぞれを再懸濁します。 </li><li>変換utのための栄養要求性マーカー遺伝子（ 例えば 、URA3）を ilizing、適切な選択培地寒天（ 例えばウリジンを欠く）の上にソリューションをピペッティングすることにより、各混合物全体をメッキし、滅菌ガラスビーズを用いて均一に混合物を広げました。 </li><li>ここに記載されるようにヌーセオスリシン耐性マーカー遺伝子（NAT1）を利用して変換するために、プレートの変換は、非選択YPAD寒天上に最初に混合し、6-12時間30℃でインキュベートします。ストレスをヌーセオスリシン前の細胞の回復、ポストヒートショックでこのステップ助剤は、適用されます。 </li><li>部分的な成長の回復後、YPAD上にレプリカプレートカンジダ細胞が400μgの/ mlのヌーセオスリシン含みます。栄養マーカー遺伝子（ 例えば、URA3） を利用して変換するために、この中間のめっき工程が不要であり、4.4.2に記載のように細胞を直接選択酵母媒体（ 例えば YPAD欠くウリジン）上にプレーティングすることができます。 注：変換が成功した場合、列oniesは（ヌーセオスリシン含む寒天上での選択のための成長の潜在的に5日まで）1〜3日以内に表示されます。いいえコロニーは、単独でキャリアDNA（ネガティブコントロール）を含有する形質転換ミックスで拡散板に表示されないはずです。 </li></ol></li><li>栄養要求性とヌーセオスリシンマーカー選択のために、新鮮な選択培地寒天プレートに単一コロニーとしてスジ推定される形質転換体とFP融合の成功の建設のためにスクリーニングすることができる酵母細胞を増殖させるために30℃でインキュベートします。 </li><li>タギングカセットの正しい統合のための画面の形質転換体（詳しい例えば代表的な結果を参照してください）。目的の遺伝子は、十分な量で発現される場合、全体のコロニーの蛍光は、蛍光検出能力のプレートイメージングシステムを使用して、潜在的な候補の組込みを検出することができるように、発生する可能性があります。 <ol><li> outsid配列とプライマーの相同性を用いたPCRによる推定の組込みを確認します積分領域の電子は、標的遺伝子への融合を確認しました。 </li><li>既知の場合に加えて、タンパク質の局在を視覚的に確認のための単一細胞の蛍光顕微鏡検査によって、ならびに、融合タンパク質の発現およびサイズを決定するために、ウェスタンブロット分析を考えます。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bendel, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+and+epithelial+adhesion+in+the+pathogenesis+of+neonatal+candidiasis.">Colonization and epithelial adhesion in the pathogenesis of neonatal candidiasis.</a> Semin. Perinatol. 27 (5), 357-364 (2003).</li><li>Gerami-Nejad, M., Berman, J., Gale, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassettes+for+PCR-mediated+construction+of+green,+yellow,+and+cyan+fluorescent+protein+fusions+in+Candida+albicans.">Cassettes for PCR-mediated construction of green, yellow, and cyan fluorescent protein fusions in Candida albicans.</a> Yeast. 18 (9), 859-864 (2001).</li><li>Gerami-Nejad, M., Dulmage, K., Berman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+cassettes+for+epitope+and+fluorescent+fusion+proteins+in+Candida+albicans.">Additional cassettes for epitope and fluorescent fusion proteins in Candida albicans.</a> Yeast. 26 (7), 399-406 (2009).</li><li>Gerami-Nejad, M., Forche, A., McClellan, M., Berman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+function+in+clinical+C.+albicans+isolates.">Analysis of protein function in clinical C. albicans isolates.</a> Yeast. 29 (8), 303-309 (2012).</li><li>Gerami-Nejad, M., Hausauer, D., McClellan, M., Berman, J., Gale, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassettes+for+the+PCR-mediated+construction+of+regulatable+alleles+in+Candida+albicans.">Cassettes for the PCR-mediated construction of regulatable alleles in Candida albicans.</a> Yeast. 21 (5), 429-436 (2004).</li><li>Gonia, S., Larson, B., Gale, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+gene+modification+strategy+for+construction+of+fluorescent+protein+fusions+in+Candida+parapsilosis.">PCR-mediated gene modification strategy for construction of fluorescent protein fusions in Candida parapsilosis.</a> Yeast. 33 (2), 63-69 (2016).</li><li>Milne, S. W., Cheetham, J., Lloyd, D., Aves, S., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassettes+for+PCR-+mediated+gene+tagging+in+Candida+albicans+utilizing+nourseothricin+resistance.">Cassettes for PCR- mediated gene tagging in Candida albicans utilizing nourseothricin resistance.</a> Yeast. 28 (12), 833-841 (2011).</li><li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (1995).</li><li>Wilson, R. B., Davis, D., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hypothesis+testing+with+Candida+albicans+through+gene+disruption+with+short+homology+regions.">Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions.</a> J. Bacteriol. 181 (6), 1868-1874 (1999).</li><li>Pulver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rsr1+focuses+Cdc42+activity+at+hyphal+tips+and+promotes+maintenance+of+hyphal+development+in+Candida+albicans.">Rsr1 focuses Cdc42 activity at hyphal tips and promotes maintenance of hyphal development in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (4), 482-495 (2013).</li><li>Falgier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+species+differ+in+their+interactions+with+immature+human+gastrointestinal+epithelial+cells.">Candida species differ in their interactions with immature human gastrointestinal epithelial cells.</a> Pediatr. Res. 69 (5), 384-389 (2011).</li><li>Nosek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+pathogenic+yeast+Candida+parapsilosis.">Genetic manipulation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis.</a> Curr. Genet. 42 (1), 27-35 (2002).</li><li>Zemanova, J., Nosek, J., Tomaska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+the+pathogenic+yeast+Candida+parapsilosis.">High-efficiency transformation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis.</a> Curr. Genet. 45 (3), 183-186 (2004).</li><li>Benjamin, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+candidiasis+among+extremely+low+birth+weight+infants:+risk+factors,+mortality+rates,+and+neurodevelopmental+outcomes+at+18+to+22+months.">Neonatal candidiasis among extremely low birth weight infants: risk factors, mortality rates, and neurodevelopmental outcomes at 18 to 22 months.</a> Pediatrics. 117 (1), 84-92 (2006).</li><li>Kullberg, B. J., Arendrup, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+Candidiasis.">Invasive Candidiasis.</a> N Engl J Med. 373 (15), 1445-1456 (2015).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

エピトープの構造は、上述したPCRによる遺伝子改変戦略を使用してカンジダ種における配列は3段階のプロセスとして要約することができるタグを付けました。まず、カセットは、両方の酵母ゲノムへの挿入の遺伝子座に相同な統合および領域に対して所望の配列をコードするPCRによって行われます。次に、形質転換される酵母細胞は、酢酸リチウムと化学的にコンピテントにされ、カ...

カンジダ種は、すべての人間の腸や尿生殖路を植民地化共生菌で。その結果として免疫不全の条件、早産または癌の治療の免疫抑制作用で発生する下では、 カンジダ種は、日和見病原体になることができます。 カンジダ種のうち、 カンジダ・アルビカンスは、最も一般的な真菌の植民あり、侵襲性真菌感染症の大部分の原因となります。このようなC.グラブラタ 、C。パラプシローシス 、C。トロピカリス 、Cのような他のカンジダ種は、また、いくつかの展示固有抵抗で、免疫不全患者で重篤な感染症を引き起こすkruseii一般的にしたがって、このようなフルコナゾールやアムホテリシンBのような抗真菌性抗生物質を使用しますこれらの種のいくつかの感染は、特に抗真菌剤で予防的に治療を受けている患者では、より頻繁に観察されています。でも適切かつタイムリーなAとNTI-真菌治療は、侵襲性カンジダ感染症はかなりの罹患率と死亡率1と関連することを続けています。しかし、人の健康におけるカンジダ種の意義、その病因機構の研究と解明を可能にする、容易に入手可能な分子ツールの必要性があります。 研究者が視覚化し、微生物細胞とそれらが発現するタンパク質を定量化することを可能にする一つの重要なツールは、FP融合技術です。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）媒介遺伝子改変は、この論文に記載のように、FP配列、そのゲノム遺伝子座に目的の配列をコードカンジダタンパク質との間の融合物の構築を可能にします。構築物の安定な組込みは、タンパク質発現の解析だけでなく、タンパク質の局在のダイナミクスを容易にします。 FP配列を含むプラスミドは、 カンジダ・アルビカンスにおける発現のために最適化され、それは、PCR媒介Gで使用することができエン修飾戦略は、以前に2、3、4、5が構築されています。 C.アルビカンス及びC.パラプシローシス 2、3、4、5、6、7の変換を促進する栄養マーカー遺伝子に連結されたFPの配列：プラスミドはFP変換「カセット」を含みます。現在利用可能なプラスミドは選択可能な栄養栄養要求株の形質転換のためのマーカー遺伝子（URA3、HIS1、ARG4）だけでなく、栄養要求性を欠く臨床株の形質転換を容易に支配的な薬剤耐性マーカー（NAT1）、さまざまな含まれています。また、プラスミドは、最大4つの異なるFPシーケンス（緑[GFP]、YELLOのオプションが含まれています【YFP]ワット、シアン[CFP]、および桜[mCherryを]）およびカルボキシ末端タンパク質融合物の建設、またはアミノ末端タンパク質融合体の構築のためのプロモーター配列のためのADH1終結配列のいずれか。プライマーは、FPカセットを囲むプラスミドDNAの相同性を有するように設計されています。また、プライマーはまた、相同組換え（ 図1）を介してゲノム座にカセットの組込みを容易にタグ付けされるべき関心の酵母遺伝子に相同性をもつ5&#39;-延長配列を含みます。遺伝子特異的FPカセットは、PCRによって生成され、酢酸リチウムで処理することによりDNAの取り込みのためにコンピテントカンジダ細胞に形質転換されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55333/55333fig1.jpg" /> 図1：FPシーケンス融合がカンジダ種にどのように生成されるかの図。 （A）プラスミドDNAはこちらよりエスFP配列および抵抗ヌーセオスリシンをコードする配列（NAT1）。フォワード（FWD）およびリバース（REV）プライマーの相対的位置は、プラスミド配列と相同性の領域を示すプライマーおよび遺伝子特異的相同領域またはプライマー伸長を示す紫色の部分の黒い部分で示されています。 （B）FPカセットは、 カンジダに形質転換し、相同組換え（点線）を介してENO1ゲノム遺伝子座の中に統合されています。 ENO1の3 &#39;末端にFP融合配列を得られた（C）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55333/55333fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ここで、我々は、 カンジダ種におけるタンパク質融合（ENO1-FP）の構造の例を提示します。私たちは、GFP、YFPをコードする配列とともにNAT1の形質転換マーカー遺伝子を含むタグ付けするプラスミドを使用しますか、mCherryを（ 図2）。これらのプラスミドは、そのカルボキシ末端でのFPに融合ENO1の発現をもたらす、ENO1の3 &#39;末端へのFPの融合を促進する遺伝子特異的カセットを生成するために、PCRにおけるプライマーと一緒に使用されています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55333/55333fig2.jpg" /> 図2：FPカセットを含むプラスミドのマップ。フォワード（F）および逆方向（R）プラスミドからカセットを生成するために使用されるプライマーは、プラスミドに対する相同性の相対的な位置と共に示されています。 表1に記載されたプライマー配列です。 F1およびR1もpYFP- NAT1カセットを生成するために使用しました。 YFP- NAT1カセット （pMG2263）を含有するプラスミドは、GFP配列の代わりにYFPを除いてpMG2120と同じです。カセットサイズ：GFP-NAT1、3.7 kbpの。 mCherry- NAT1、3.2 kbpの。 YFP- NAT1、3。7 kbpの。この図は、Gerami-Nejad、 らから変更されています。 4 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55333/55333fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>100 W mercury lamp</td><td>CHIU Technical Corporation</td><td>M-100T</td><td></td></tr><tr><td>95% Ethanol</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Carrier DNA</td><td>Ambion</td><td>AM9680</td><td>Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml</td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Photometrics</td><td>CoolSNAP HQ</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tube</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Culture Tube Rotator</td><td>New Brunswick</td><td>2013923</td><td>TC-8, or Any Culture Tube Rotator</td></tr><tr><td>Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>022363719, 022363212</td><td>0.5 ml, 1.5 ml</td></tr><tr><td>Erlenmeyer Flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>7250089</td><td>125 ml</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Freezer (-80 &amp;deg;C)</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>ULT-1386-9-V</td><td>Revco Ultima II</td></tr><tr><td>GFP, YFP and Texas Red Filter Sets</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td>49002, 86004v2, 49008</td><td></td></tr><tr><td>Glass culture tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>1496126</td><td>75 mm</td></tr><tr><td>HRP goat anti-mouse antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2005</td><td></td></tr><tr><td>HRP goat anti-rabbit antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2301</td><td></td></tr><tr><td>Incubator (30 &amp;deg;C)</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Acetate</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB) Media</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>E600</td><td>Nikon Eclipse E600</td></tr><tr><td>Microscope Image Analysis Software</td><td>Universal Imaging Corporation</td><td>6.3r7</td><td>MetaMorph Software Series 6.3r7</td></tr><tr><td>Mouse anti-GFP antibody</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td></td></tr><tr><td>Nourseothricin</td><td>Fisher Scientific</td><td>50997939</td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>9700</td><td>GeneAmp PCR System</td></tr><tr><td>PCR tubes</td><td>BioExpress, GeneMate</td><td>T-3035-1</td><td>0.2 ml</td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-mCherry antibody</td><td>BioVision</td><td>5993-100</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerator (4 &amp;deg;C)</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Table Top Centrifuge</td><td>Labnet</td><td>Z 400</td><td>Hermle Z 400</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; DNA Polymerase</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Vortex Genie 2</td></tr><tr><td>Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of fluorescent protein fusions in candida species

カンジダ種、腸管および尿生殖路の流行入植は、ヒトにおける侵襲性真菌感染症の大部分の原因となっています。このように、分子および遺伝子ツールは、それらの病因メカニズムの研究を促進するために必要とされています。 PCRによる遺伝子改変は、それらの検出を容易にするために、エピトープタグ融合タンパク質を生成する簡単かつ迅速なアプローチです。具体的には、蛍光タンパク質（FP）の融合体は、それぞれ、蛍光顕微鏡および免疫ブロッティングにより酵母細胞およびタンパク質の両方の可視化および定量化を可能にする強力なツールです。 FPをコードする配列を含むプラスミドは、 カンジダ種の形質転換を促進する栄養マーカー遺伝子と共に、 カンジダにおけるFPの構造および発現のために生成されています。ここで、我々は、 カンジダ種にFP融合を構築するための方策を提示します。ヌーセオスリシンresistaを含むプラスミドNCEの形質転換マーカー遺伝子（NAT1）、緑、黄、またはチェリーのFP（GFP、YFP、mCherryを）のいずれかのための配列は、FPカセットを生成するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で、遺伝子特異的な配列を含むプライマーと一緒に使用されるとともに。この遺伝子特異的カセットは、相同組換えを介して、対応する遺伝子座の3 &#39;末端に統合する能力を有しています。関心対象の遺伝子座にFPシーケンスが正常にインフレーム融合は、顕微鏡および/または免疫検出法により、融合タンパク質発現の分析に続いて、遺伝的に検証されます。また、高度に発現されたタンパク質の場合について、成功した融合体は、主に蛍光イメージング技術によってスクリーニングすることができます。

一例として、我々は、プロトコルを使用するC.パラプシローシスの実験室株でENO1するGFPとmCherryを融合物を構築するために、上述。各推定形質転換体は、最初は成長のために再ストリークしました。得られた融合タンパク質が高度に発現されるので、この例では（エノラーゼ）とFPを明るく、我々は前の診断PCR（ 図 3）6を</...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species at JoVE.com

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

PCRによる遺伝子改変は、酵母細胞およびタンパク質の可視化および定量化を容易にする、 カンジダ種で蛍光タンパク質融合体を生成するために使用することができます。ここで、我々は、 カンジダ・パラプシロシスに蛍光タンパク質融合（ENO1-FP）を構築するための方策を提示します。

蛍光タンパク質融合物中の生成<em&gt;カンジダ</em&gt;種

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

generation-of-fluorescent-protein-fusions-in-candida-species

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

10.6K ビュー.  University of Minnesota.  PCRによる遺伝子改変は、酵母細胞およびタンパク質の可視化および定量化を容易にする、 カンジダ種で蛍光タンパク質融合体を生成するために使用することができます。ここで、我々は、 カンジダ・パラプシロシスに蛍光タンパク質融合（ENO1-FP）を構築するための方策を提示します。 

ビデオ: Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

細胞内の内腔の形態形成と単一細胞におけるIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫排泄管: GFP 融合、RNAi 操作画面やイメージングによるラベリング

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

発生生物学

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

日和見菌病原体への蛍光タグ付き遺伝子のバイオリスティック変容<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

免疫・感染学

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

生化学

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

スペクトル的に解決された二光子顕微鏡を用いたGタンパク質共役受容体相互作用の in vivo定量で

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

生物学

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic changes are regulated by a complex signaling network controlled in response to environmental stimuli. These regulatory components have been highly studied, but almost all studies use a variety of in vitro stimuli to trigger filamentation. To determine how morphogenesis is regulated during the pathogenesis process, we developed an in vivo microscopy system to obtain high spatial resolution images of organisms undergoing hyphal formation within the mammalian host. The protocol presented here describes the use of this system to screen small collections of C. albicans mutant strains, allowing us to identify key regulators of morphogenesis as it occurs at the site of infection. Representative results are presented, demonstrating that some regulators of morphogenesis, such as the transcriptional regulator Efg1, have consistent phenotypes in vitro and in vivo, whereas other regulators, such as adenyl cyclase (Cyr1), have significantly different phenotypes in vivo compared to in vitro.

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

This manuscript describes a method for screening moderately sized Candida albicans mutant libraries for morphogenesis phenotypes during active infection in a mammalian host using non-invasive confocal microscopy.

哺乳類宿主における活動感染中のカンジダ・アルビカンス変異株の形態形成表現型をスクリーニングするためのin vivoイメージングの使用

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

カンジダ・アルビカンス関連カテーテル関連感染症のマウスモデルの確立

A Catheter-Related Candida albicans Infection Model in Mouse

Catheter-related infection (CRI) is a common nosocomial infection caused by candida albicans during catheter implantation. Typically, biofilms are formed on the outer surface of the catheter and lead to disseminated infections, which are fatal to patients. There are no effective prevention and treatment management in clinics. Therefore, it is urgent to establish an animal model of CRI for the preclinical screening of new strategies for its prevention and treatment. In this study, a polyethylene catheter, a widely used medical catheter, was inserted into the back of the BALB/c mice after hair removal. Candida albicans ATCC MYA-2876 (SC5314) expressing enhanced green fluorescent protein was subsequently inoculated on the skin's surface along the catheter. Intense fluorescence was observed on the surface of the catheter under a fluorescent microscope 3 days later. Mature and thick biofilms were found on the surface of the catheter via scanning electron microscopy. These results indicated the adhesion, colonization, and biofilm formation of candida albicans on the surface of the catheter. The hyperplasia of the epidermis and the infiltration of inflammatory cells in the skin specimens indicated the histopathological changes of the CRI-associated skin. To sum up, a mouse CRI model was successfully established. This model is expected to be helpful in the research and development of therapeutic management for candida albicans associated CRI.

著者スポットライト:蛍光タンパク質標識を使用したカテーテル感染症におけるカンジダ・アルビカンス検出の強化 

We establish a mouse model of C.albicans-associated catheter-related infection (CRI), in which biofilm forms on the catheter, and the interaction between C.albicans and host correlates well with the clinical CRI. This model helps screen therapies for C.albicans biofilm-associated CRI, laying a foundation for clinical transformation.

マウスにおけるカテーテル関連 カンジダ・アルビカンス 感染モデル

Catheter-related infection (CRI) is a common nosocomial infection caused by candida albicans during catheter implantation. Typically, biofilms are formed ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

分裂酵母セクシャルライフサイクルの顕微鏡観察

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

蛍光タンパク質融合物中の生成

要約

さらに動画を探す

この動画の章

細胞内の内腔の形態形成と単一細胞におけるIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫排泄管: GFP 融合、RNAi 操作画面やイメージングによるラベリング

日和見菌病原体への蛍光タグ付き遺伝子のバイオリスティック変容

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

スペクトル的に解決された二光子顕微鏡を用いたGタンパク質共役受容体相互作用の in vivo定量で

分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

哺乳類宿主における活動感染中のカンジダ・アルビカンス変異株の形態形成表現型をスクリーニングするためのin vivoイメージングの使用

マウスにおけるカテーテル関連カンジダ・アルビカンス感染モデル

マウスにおけるカテーテル関連カンジダ・アルビカンス感染モデル

マウスにおけるカテーテル関連カンジダ・アルビカンス感染モデル

分裂酵母セクシャルライフサイクルの顕微鏡観察

蛍光タンパク質融合物中の生成

要約

さらに動画を探す

この動画の章

細胞内の内腔の形態形成と単一細胞におけるIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫排泄管: GFP 融合、RNAi 操作画面やイメージングによるラベリング

日和見菌病原体への蛍光タグ付き遺伝子のバイオリスティック変容

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

スペクトル的に解決された二光子顕微鏡を用いたGタンパク質共役受容体相互作用の in vivo定量で

分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

哺乳類宿主における活動感染中のカンジダ・アルビカンス変異株の形態形成表現型をスクリーニングするためのin vivoイメージングの使用

マウスにおけるカテーテル関連 カンジダ・アルビカンス 感染モデル

マウスにおけるカテーテル関連 カンジダ・アルビカンス 感染モデル

マウスにおけるカテーテル関連 カンジダ・アルビカンス 感染モデル

分裂酵母セクシャルライフサイクルの顕微鏡観察

マウスにおけるカテーテル関連カンジダ・アルビカンス感染モデル

マウスにおけるカテーテル関連カンジダ・アルビカンス感染モデル

マウスにおけるカテーテル関連カンジダ・アルビカンス感染モデル