私たちは、元のmCherryをFPシーケンスを提供するためのN.ディーンに感謝、M. Gerami-Nejadプラスミドの構築のために、このプロジェクトの開発中に有益な助言のための技術支援のためのB.ラーソン、およびT. Heisel。 JBは、欧州研究評議会上級賞340087（RAPLODAPT）によってサポートされていました。顕微鏡およびイメージングシステムは、ミネソタ小児科財団の大学とミネソタイメージングセンターの大学によって提供されました。

大腸菌から1アイソテンプレートプラスミド<ol><li>振盪しながら37℃で10 mlのLB培地（LB）+ 200 mg / Lのアンピシリン（AMP）で一晩鋳型プラスミドを含む大腸菌を成長させます。 </li><li> 2分間6000×gで遠心分離によって細胞を回収します。 </li><li>液体をデカントし、のAusubelに前述したようにらの標準的な方法により、 大腸菌細胞からDNAを単離および精製します。 8。 </li><li>トリスEDTA中で再懸濁したDNA（TE、10mMトリス、pH8.0の、1mMのEDTA、pH8.0）で50〜100 ng / mlでの作業濃度で。 </li></ol> 2.デザインプライマー<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="0.5in" style="width:50px"> プライマー </td><td> プライマー配列 </td></tr><tr><td> F1 </td><td> 5 &#39; <strong&gt; GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTTCTAAAGGTGAAGAATTATT 3 &#39; </td></tr><tr><td> R1 </td><td> 5 &#39;GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> F2 </td><td> 5 &#39;GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 &#39; </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 5 &#39;GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 &#39; </td></tr></tbody></table> 表1：本研究で用いたプライマー配列。太字イタリック体のテキストは、通常のフォント領域はプラスミドDNAに相同である、ENO1ゲノム遺伝子座と相同性を示しています。 <ol> &lt;李&gt;デザインプライマーは、遺伝子のゲノム遺伝子座への組換えを容易にするために、目的の標的遺伝子の3 &#39;末端（ 例えば ENO1）に同様に増幅されるカセットに隣接する配列をプラスミドに相同であることにする（ 図2、 表1） 。 <ol><li>なるように符号化フレームに加え、プラスミド配列の最初の約30塩基対を維持するために、フォワードプライマーの配列は、最後の目的の遺伝子の70塩基対（bp）、5&#39;-3 &#39;、マイナス停止コドンと一致していることを確認増幅されました。注意点としては、各プライマーでGGTGGTGGTTなしFP相同性を有するポリグリシンリンカーです。注目すべきは、リンカーの非存在下では、理論的には、タンパク質ミスフォールディング、タンパク質産生の低い収率、又は障害の生物活性をもたらすことができ、機能的ドメインの直接的な融合が存在することができます。 </li><li>リバースプライマー配列は、遺伝子の70 bpのすぐ下流にあることを確認してください3 &#39;、5&#39;、任意の遺伝子配列に加え、最後のアプロを含みませんximatelyプラスミドで使用される栄養または薬剤耐性マーカーの30bpの。 </li><li>利用F1およびR1はpMG2343でmCherry- NAT1を生成するpMG2120とpMG2263、それぞれとF2とR2とのGFP-NAT1とYFP- NAT1カセットを生成します。 </li></ol></li></ol> 3. PCRによりFPカセットを生成します（1日目） <ol><li> PCR用試薬を準備します。 1.5ミリリットルチューブに以下の体積および濃度を追加することによって、マスターミックス（500μlの最終容量）を行います。50μlのPCR緩衝液（500mMの塩化カリウム、水中の100 mMトリスpHは8.0）、20μlのデオキシヌクレオチド（dNTP類;原料混合物各10mMのヌクレオチド）、40μlの25 mMの〜50-100 ngの/μlのストック溶液から塩化マグネシウム、20μlの精製されたプラスミド（）、10μlの各フォワードのと、（）10mMストック溶液から30μlのTaqポリメラーゼを逆方向プライマーポリメラーゼ（ジェネリック、5000単位/ ml）、および320μlの水。 <ol><li> 10 PCR-の互換性がのそれぞれにマスターミックスのアリコート50μlのル0.5ミリリットルチューブ。 </li></ol></li><li>次の手順をサーモサイクラーにPCRチューブを配置し、実行：1サイクル分5を94℃で二本鎖DNAを変性させ; 94℃で45秒の40サイクルを順次、55℃で30秒のプライマーは、プラスミド鋳型DNAにアニールすることを可能にし、DNA産物の伸長のために68℃で4分間します。 72℃で15分の1の最終伸長サイクル。 注：PCRマスターミックス、サイクリングパラメータは、使用される特定のTaqポリメラーゼに基づいて変更する必要があります。 </li><li>プール1.5mlチューブ内の10のPCR反応からのすべての製品。 <ol><li>アガロースゲル電気泳動にプールされたPCR産物の主題5μlのDNAラダーとの比較に基づいて、アンプリコンのサイズを確認し、生成物濃​​度の推定値を得ます。一般的に、後続の各形質転換混合物にカセットDNAの〜250μgのを使用します。 </li><li>生成物を750μlの95％エタノール、続いて50μlの3M酢酸ナトリウムを添加することによってDNAを沈殿させ、少なくとも30分間インキュベート-20℃で</li><li> 10分間16,000×gでチューブを遠心分離することにより、PCR産物を収穫。慎重に除去し、上清を捨て、一晩ペレットを乾燥させます。 40μlのTE pH8.0の中で乾燥させたDNAカセットペレットを再懸濁し、使用するまで室温で保管してください。 </li></ol></li></ol> 4. FP DNAカセットでカンジダ細胞を形質転換<ol><li> 1日目に、いくつかのストリーキングによって凍結15％グリセロール（-80°C）在庫から変換される回復する酵母株はアデニン（YPAD）寒天で酵母ペプトンデキストロース上に結晶を掻き取り、30℃でインキュベートします。コロニー増殖の回復後、通気キャップを有するガラス培養管2mlの液体YPAD培地に単一コロニーを接種し、攪拌しながら30℃で一晩インキュベートします。 </li><li> 2日目、通気性キャップと125ミリリットルの三角フラスコに（0.2〜の最終OD 600）新鮮なYPAD 50ミリリットルに一晩の酵母培養物の300μlの希釈します。 30℃で振ります（最終OD 600〜0.6から0.8へ）〜3時間。 <ol><li> 50ミリリットルコニカルチューブに一晩培養物を注ぎ、テーブルトップ遠心機で1 500×gで5分間回転させることによって細胞をペレット化。 </li><li>捨て、適切に上清を捨てます。 5ミリリットルの水で細胞ペレットを再懸濁します。テーブルトップ遠心機で1,500×gで5分間再度遠心分離して細胞を再ことペレット。 </li><li>捨て、適切に上清を捨てます。 1.5mlチューブに転送中：500μlのTELiAc（10 mMトリス、pH8.0,1mMのEDTA、pHが8.0、0.1 M酢酸リチウムTEの酢酸リチウム）で細胞を再懸濁します。微量で3000×gで2分間遠心操作を。 </li><li> 250μlのTELiAcで細胞を再懸濁し。ペレットを含む総体積は〜300μlのでなければなりません。 </li></ol></li><li>クリーン（4.2.4とは異なるマイクロチューブ）に、5μlのキャリアDNA（10mg / ml）および（4.2.4）から調製したカンジダ細胞の150μlのを追加します。これは、トンの陰性対照でありますransformation。 <ol><li>第二の清浄なマイクロチューブに、変性キャリアDNA5μlの（すなわち、10分間90℃で煮沸し、4℃に冷却されている）、（3.3.1）から調製されたPCR産物の全てを40μlおよび150を追加（4.2.4）から調製したカンジダ細胞 μlの。 </li><li>室温で30分のための2つの形質転換混合物をインキュベートします。 </li><li>各形質転換混合管に、700μlのプレートミックス（10mMのトリス、pH8.0の、1mMのEDTA、pH8.0の、50％のポリエチレングリコール3350 0.1 M酢酸リチウム）を加えます。 RTで一晩、それらを混合し、インキュベートするチューブを反転。 </li></ol></li><li> 3日目に、変換は1時間42°C（ヒートショック）でミックスインキュベートします。 <ol><li>遠心分離機変換は微量で16,000×gで30秒間混合します。削除し、適切に上清を捨てます。細胞に損傷を与えないようにダウンして静かにピペッティングにより150μlの水で細胞ペレットのそれぞれを再懸濁します。 </li><li>変換utのための栄養要求性マーカー遺伝子（ 例えば 、URA3）を ilizing、適切な選択培地寒天（ 例えばウリジンを欠く）の上にソリューションをピペッティングすることにより、各混合物全体をメッキし、滅菌ガラスビーズを用いて均一に混合物を広げました。 </li><li>ここに記載されるようにヌーセオスリシン耐性マーカー遺伝子（NAT1）を利用して変換するために、プレートの変換は、非選択YPAD寒天上に最初に混合し、6-12時間30℃でインキュベートします。ストレスをヌーセオスリシン前の細胞の回復、ポストヒートショックでこのステップ助剤は、適用されます。 </li><li>部分的な成長の回復後、YPAD上にレプリカプレートカンジダ細胞が400μgの/ mlのヌーセオスリシン含みます。栄養マーカー遺伝子（ 例えば、URA3） を利用して変換するために、この中間のめっき工程が不要であり、4.4.2に記載のように細胞を直接選択酵母媒体（ 例えば YPAD欠くウリジン）上にプレーティングすることができます。 注：変換が成功した場合、列oniesは（ヌーセオスリシン含む寒天上での選択のための成長の潜在的に5日まで）1〜3日以内に表示されます。いいえコロニーは、単独でキャリアDNA（ネガティブコントロール）を含有する形質転換ミックスで拡散板に表示されないはずです。 </li></ol></li><li>栄養要求性とヌーセオスリシンマーカー選択のために、新鮮な選択培地寒天プレートに単一コロニーとしてスジ推定される形質転換体とFP融合の成功の建設のためにスクリーニングすることができる酵母細胞を増殖させるために30℃でインキュベートします。 </li><li>タギングカセットの正しい統合のための画面の形質転換体（詳しい例えば代表的な結果を参照してください）。目的の遺伝子は、十分な量で発現される場合、全体のコロニーの蛍光は、蛍光検出能力のプレートイメージングシステムを使用して、潜在的な候補の組込みを検出することができるように、発生する可能性があります。 <ol><li> outsid配列とプライマーの相同性を用いたPCRによる推定の組込みを確認します積分領域の電子は、標的遺伝子への融合を確認しました。 </li><li>既知の場合に加えて、タンパク質の局在を視覚的に確認のための単一細胞の蛍光顕微鏡検査によって、ならびに、融合タンパク質の発現およびサイズを決定するために、ウェスタンブロット分析を考えます。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bendel, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+and+epithelial+adhesion+in+the+pathogenesis+of+neonatal+candidiasis.">Colonization and epithelial adhesion in the pathogenesis of neonatal candidiasis.</a> Semin. Perinatol. 27 (5), 357-364 (2003).</li><li>Gerami-Nejad, M., Berman, J., Gale, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassettes+for+PCR-mediated+construction+of+green,+yellow,+and+cyan+fluorescent+protein+fusions+in+Candida+albicans.">Cassettes for PCR-mediated construction of green, yellow, and cyan fluorescent protein fusions in Candida albicans.</a> Yeast. 18 (9), 859-864 (2001).</li><li>Gerami-Nejad, M., Dulmage, K., Berman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+cassettes+for+epitope+and+fluorescent+fusion+proteins+in+Candida+albicans.">Additional cassettes for epitope and fluorescent fusion proteins in Candida albicans.</a> Yeast. 26 (7), 399-406 (2009).</li><li>Gerami-Nejad, M., Forche, A., McClellan, M., Berman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+function+in+clinical+C.+albicans+isolates.">Analysis of protein function in clinical C. albicans isolates.</a> Yeast. 29 (8), 303-309 (2012).</li><li>Gerami-Nejad, M., Hausauer, D., McClellan, M., Berman, J., Gale, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassettes+for+the+PCR-mediated+construction+of+regulatable+alleles+in+Candida+albicans.">Cassettes for the PCR-mediated construction of regulatable alleles in Candida albicans.</a> Yeast. 21 (5), 429-436 (2004).</li><li>Gonia, S., Larson, B., Gale, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+gene+modification+strategy+for+construction+of+fluorescent+protein+fusions+in+Candida+parapsilosis.">PCR-mediated gene modification strategy for construction of fluorescent protein fusions in Candida parapsilosis.</a> Yeast. 33 (2), 63-69 (2016).</li><li>Milne, S. W., Cheetham, J., Lloyd, D., Aves, S., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassettes+for+PCR-+mediated+gene+tagging+in+Candida+albicans+utilizing+nourseothricin+resistance.">Cassettes for PCR- mediated gene tagging in Candida albicans utilizing nourseothricin resistance.</a> Yeast. 28 (12), 833-841 (2011).</li><li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (1995).</li><li>Wilson, R. B., Davis, D., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hypothesis+testing+with+Candida+albicans+through+gene+disruption+with+short+homology+regions.">Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions.</a> J. Bacteriol. 181 (6), 1868-1874 (1999).</li><li>Pulver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rsr1+focuses+Cdc42+activity+at+hyphal+tips+and+promotes+maintenance+of+hyphal+development+in+Candida+albicans.">Rsr1 focuses Cdc42 activity at hyphal tips and promotes maintenance of hyphal development in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (4), 482-495 (2013).</li><li>Falgier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+species+differ+in+their+interactions+with+immature+human+gastrointestinal+epithelial+cells.">Candida species differ in their interactions with immature human gastrointestinal epithelial cells.</a> Pediatr. Res. 69 (5), 384-389 (2011).</li><li>Nosek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+pathogenic+yeast+Candida+parapsilosis.">Genetic manipulation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis.</a> Curr. Genet. 42 (1), 27-35 (2002).</li><li>Zemanova, J., Nosek, J., Tomaska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+the+pathogenic+yeast+Candida+parapsilosis.">High-efficiency transformation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis.</a> Curr. Genet. 45 (3), 183-186 (2004).</li><li>Benjamin, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+candidiasis+among+extremely+low+birth+weight+infants:+risk+factors,+mortality+rates,+and+neurodevelopmental+outcomes+at+18+to+22+months.">Neonatal candidiasis among extremely low birth weight infants: risk factors, mortality rates, and neurodevelopmental outcomes at 18 to 22 months.</a> Pediatrics. 117 (1), 84-92 (2006).</li><li>Kullberg, B. J., Arendrup, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+Candidiasis.">Invasive Candidiasis.</a> N Engl J Med. 373 (15), 1445-1456 (2015).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

エピトープの構造は、上述したPCRによる遺伝子改変戦略を使用してカンジダ種における配列は3段階のプロセスとして要約することができるタグを付けました。まず、カセットは、両方の酵母ゲノムへの挿入の遺伝子座に相同な統合および領域に対して所望の配列をコードするPCRによって行われます。次に、形質転換される酵母細胞は、酢酸リチウムと化学的にコンピテントにされ、カ...

カンジダ種は、すべての人間の腸や尿生殖路を植民地化共生菌で。その結果として免疫不全の条件、早産または癌の治療の免疫抑制作用で発生する下では、 カンジダ種は、日和見病原体になることができます。 カンジダ種のうち、 カンジダ・アルビカンスは、最も一般的な真菌の植民あり、侵襲性真菌感染症の大部分の原因となります。このようなC.グラブラタ 、C。パラプシローシス 、C。トロピカリス 、Cのような他のカンジダ種は、また、いくつかの展示固有抵抗で、免疫不全患者で重篤な感染症を引き起こすkruseii一般的にしたがって、このようなフルコナゾールやアムホテリシンBのような抗真菌性抗生物質を使用しますこれらの種のいくつかの感染は、特に抗真菌剤で予防的に治療を受けている患者では、より頻繁に観察されています。でも適切かつタイムリーなAとNTI-真菌治療は、侵襲性カンジダ感染症はかなりの罹患率と死亡率1と関連することを続けています。しかし、人の健康におけるカンジダ種の意義、その病因機構の研究と解明を可能にする、容易に入手可能な分子ツールの必要性があります。 研究者が視覚化し、微生物細胞とそれらが発現するタンパク質を定量化することを可能にする一つの重要なツールは、FP融合技術です。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）媒介遺伝子改変は、この論文に記載のように、FP配列、そのゲノム遺伝子座に目的の配列をコードカンジダタンパク質との間の融合物の構築を可能にします。構築物の安定な組込みは、タンパク質発現の解析だけでなく、タンパク質の局在のダイナミクスを容易にします。 FP配列を含むプラスミドは、 カンジダ・アルビカンスにおける発現のために最適化され、それは、PCR媒介Gで使用することができエン修飾戦略は、以前に2、3、4、5が構築されています。 C.アルビカンス及びC.パラプシローシス 2、3、4、5、6、7の変換を促進する栄養マーカー遺伝子に連結されたFPの配列：プラスミドはFP変換「カセット」を含みます。現在利用可能なプラスミドは選択可能な栄養栄養要求株の形質転換のためのマーカー遺伝子（URA3、HIS1、ARG4）だけでなく、栄養要求性を欠く臨床株の形質転換を容易に支配的な薬剤耐性マーカー（NAT1）、さまざまな含まれています。また、プラスミドは、最大4つの異なるFPシーケンス（緑[GFP]、YELLOのオプションが含まれています【YFP]ワット、シアン[CFP]、および桜[mCherryを]）およびカルボキシ末端タンパク質融合物の建設、またはアミノ末端タンパク質融合体の構築のためのプロモーター配列のためのADH1終結配列のいずれか。プライマーは、FPカセットを囲むプラスミドDNAの相同性を有するように設計されています。また、プライマーはまた、相同組換え（ 図1）を介してゲノム座にカセットの組込みを容易にタグ付けされるべき関心の酵母遺伝子に相同性をもつ5&#39;-延長配列を含みます。遺伝子特異的FPカセットは、PCRによって生成され、酢酸リチウムで処理することによりDNAの取り込みのためにコンピテントカンジダ細胞に形質転換されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55333/55333fig1.jpg" /> 図1：FPシーケンス融合がカンジダ種にどのように生成されるかの図。 （A）プラスミドDNAはこちらよりエスFP配列および抵抗ヌーセオスリシンをコードする配列（NAT1）。フォワード（FWD）およびリバース（REV）プライマーの相対的位置は、プラスミド配列と相同性の領域を示すプライマーおよび遺伝子特異的相同領域またはプライマー伸長を示す紫色の部分の黒い部分で示されています。 （B）FPカセットは、 カンジダに形質転換し、相同組換え（点線）を介してENO1ゲノム遺伝子座の中に統合されています。 ENO1の3 &#39;末端にFP融合配列を得られた（C）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55333/55333fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ここで、我々は、 カンジダ種におけるタンパク質融合（ENO1-FP）の構造の例を提示します。私たちは、GFP、YFPをコードする配列とともにNAT1の形質転換マーカー遺伝子を含むタグ付けするプラスミドを使用しますか、mCherryを（ 図2）。これらのプラスミドは、そのカルボキシ末端でのFPに融合ENO1の発現をもたらす、ENO1の3 &#39;末端へのFPの融合を促進する遺伝子特異的カセットを生成するために、PCRにおけるプライマーと一緒に使用されています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55333/55333fig2.jpg" /> 図2：FPカセットを含むプラスミドのマップ。フォワード（F）および逆方向（R）プラスミドからカセットを生成するために使用されるプライマーは、プラスミドに対する相同性の相対的な位置と共に示されています。 表1に記載されたプライマー配列です。 F1およびR1もpYFP- NAT1カセットを生成するために使用しました。 YFP- NAT1カセット （pMG2263）を含有するプラスミドは、GFP配列の代わりにYFPを除いてpMG2120と同じです。カセットサイズ：GFP-NAT1、3.7 kbpの。 mCherry- NAT1、3.2 kbpの。 YFP- NAT1、3。7 kbpの。この図は、Gerami-Nejad、 らから変更されています。 4 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55333/55333fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100W mercury lamp</td>
			<td>CHIU Technical Corporation</td>
			<td>M-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier DNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9680</td>
			<td>Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>CoolSNAP HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>50ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Tube Rotator</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>2013923</td>
			<td>TC-8, or Any Culture Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363719, 022363212</td>
			<td>0.5ml, 1.5ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7250089</td>
			<td>125ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C )</td>
			<td>Thermo Electron Corporation</td>
			<td>ULT-1386-9-V</td>
			<td>Revco Ultima II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP, YFP and Texas Red Filter Sets</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td>49002, 86004v2, 49008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1496126</td>
			<td>75mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-rabbit antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (30 &#176;C )</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Acetate</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB) Media</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E600</td>
			<td>Nikon Eclipse E600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Image Analysis Software</td>
			<td>Universal Imaging Corporation</td>
			<td>6.3r7</td>
			<td>MetaMorph Software Series 6.3r7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFP antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50997939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermocycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>9700</td>
			<td>GeneAmp PCR System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>BioExpress, GeneMate</td>
			<td>T-3035-1</td>
			<td>0.2ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 3350</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mCherry antibody</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>5993-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (4&#176;C)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Centrifuge</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>Z 400</td>
			<td>Hermle Z 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex Genie 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of fluorescent protein fusions in candida species

カンジダ種、腸管および尿生殖路の流行入植は、ヒトにおける侵襲性真菌感染症の大部分の原因となっています。このように、分子および遺伝子ツールは、それらの病因メカニズムの研究を促進するために必要とされています。 PCRによる遺伝子改変は、それらの検出を容易にするために、エピトープタグ融合タンパク質を生成する簡単かつ迅速なアプローチです。具体的には、蛍光タンパク質（FP）の融合体は、それぞれ、蛍光顕微鏡および免疫ブロッティングにより酵母細胞およびタンパク質の両方の可視化および定量化を可能にする強力なツールです。 FPをコードする配列を含むプラスミドは、 カンジダ種の形質転換を促進する栄養マーカー遺伝子と共に、 カンジダにおけるFPの構造および発現のために生成されています。ここで、我々は、 カンジダ種にFP融合を構築するための方策を提示します。ヌーセオスリシンresistaを含むプラスミドNCEの形質転換マーカー遺伝子（NAT1）、緑、黄、またはチェリーのFP（GFP、YFP、mCherryを）のいずれかのための配列は、FPカセットを生成するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で、遺伝子特異的な配列を含むプライマーと一緒に使用されるとともに。この遺伝子特異的カセットは、相同組換えを介して、対応する遺伝子座の3 &#39;末端に統合する能力を有しています。関心対象の遺伝子座にFPシーケンスが正常にインフレーム融合は、顕微鏡および/または免疫検出法により、融合タンパク質発現の分析に続いて、遺伝的に検証されます。また、高度に発現されたタンパク質の場合について、成功した融合体は、主に蛍光イメージング技術によってスクリーニングすることができます。

一例として、我々は、プロトコルを使用するC.パラプシローシスの実験室株でENO1するGFPとmCherryを融合物を構築するために、上述。各推定形質転換体は、最初は成長のために再ストリークしました。得られた融合タンパク質が高度に発現されるので、この例では（エノラーゼ）とFPを明るく、我々は前の診断PCR（ 図 3）6を</...

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Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

PCRによる遺伝子改変は、酵母細胞およびタンパク質の可視化および定量化を容易にする、 カンジダ種で蛍光タンパク質融合体を生成するために使用することができます。ここで、我々は、 カンジダ・パラプシロシスに蛍光タンパク質融合（ENO1-FP）を構築するための方策を提示します。

蛍光タンパク質融合物中の生成<em&gt;カンジダ</em&gt;種

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

generation-of-fluorescent-protein-fusions-in-candida-species

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

10.6K ビュー.  University of Minnesota.  PCRによる遺伝子改変は、酵母細胞およびタンパク質の可視化および定量化を容易にする、 カンジダ種で蛍光タンパク質融合体を生成するために使用することができます。ここで、我々は、 カンジダ・パラプシロシスに蛍光タンパク質融合（ENO1-FP）を構築するための方策を提示します。 

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High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

遺伝学

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The technique is highly efficient with millions of sequencing reads being produced in a short time span and at relatively low cost. Specifically, targeted NGS is able to focus investigations to genomic regions of particular interest based on the disease of study. Not only does this further reduce costs and increase the speed of the process, but it lessens the computational burden that often accompanies NGS. Although targeted NGS is restricted to certain regions of the genome, preventing identification of potential novel loci of interest, it can be an excellent technique when faced with a phenotypically and genetically heterogeneous disease, for which there are previously known genetic associations. Because of the complex nature of the sequencing technique, it is important to closely adhere to protocols and methodologies in order to achieve sequencing reads of high coverage and quality. Further, once sequencing reads are obtained, a sophisticated bioinformatics workflow is utilized to accurately map reads to a reference genome, to call variants, and to ensure the variants pass quality metrics. Variants must also be annotated and curated based on their clinical significance, which can be standardized by applying the American College of Medical Genetics and Genomics Pathogenicity Guidelines. The methods presented herein will display the steps involved in generating and analyzing NGS data from a targeted sequencing panel, using the ONDRISeq neurodegenerative disease panel as a model, to identify variants that may be of clinical significance.

Targeted next-generation sequencing is a time- and cost-efficient approach that is becoming increasingly popular in both disease research and clinical diagnostics. The protocol described here presents the complex workflow required for sequencing and the bioinformatics process used to identify genetic variants that contribute to disease.

対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクス パイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

CRISPR を介したゲノム人間病原菌カンジダの編集

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

非正規の開いたリーディング ・ フレームから翻訳された蛋白質を発表する OpenProt データベースを利用した質量分析を用いたプロテオミクス解析

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in regulating gene expression at the post-transcriptional level. Sequencing sRNA libraries by Next Generation Sequencing (NGS) methods has been widely employed to identify and analyze miRNA transcriptomes in the last decade, resulting in a rapid increase of miRNA discovery. However, two major challenges arise in plant miRNA annotation due to increasing depth of sequenced sRNA libraries as well as the size and complexity of plant genomes. First, many other types of sRNAs, in particular, short interfering RNAs (siRNAs) from sRNA libraries, are erroneously annotated as miRNAs by many computational tools. Second, it becomes an extremely time-consuming process for analyzing miRNA transcriptomes in plant species with large and complex genomes. To overcome these challenges, we recently upgraded miRDeep-P (a popular tool for miRNA transcriptome analyses) to miRDeep-P2 (miRDP2 for short) by employing a new filtering strategy, overhauling the scoring algorithm and incorporating newly updated plant miRNA annotation criteria. We tested miRDP2 against sequenced sRNA populations in five representative plants with increasing genomic complexity, including Arabidopsis, rice, tomato, maize and wheat. The results indicate that miRDP2 processed these tasks with very high efficiency. In addition, miRDP2 outperformed other prediction tools regarding sensitivity and accuracy. Taken together, our results demonstrate miRDP2 as a fast and accurate tool for analyzing plant miRNA transcriptomes, therefore a useful tool in helping the community better annotate miRNAs in plants.

A bioinformatics pipeline, namely miRDeep-P2 (miRDP2 for short), with updated plant miRNA criteria and an overhauled algorithm, could accurately and efficiently analyze microRNA transcriptomes in plants, especially for species with complex and large genomes.

植物におけるマイクロRNA転写物を正確かつ効率的に分析するバイオインフォマティクスパイプライン

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

ゲノムワイド往復半角化分析によるサッカロマイセス酵母の種間の熱耐性の遺伝学的マッピング

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

オミクスアプローチに対するショウジョウバエメラノガスター飛行筋肉の解剖

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Application of CRISPR Interference (CRISPRi) for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

Leptospirosis is a global neglected zoonosis, responsible for at least 1 million cases per year and almost 60 thousand deaths. The disease is caused by pathogenic and virulent bacteria of the genus Leptospira, either by direct contact with the bacteria or indirectly by exposure to contaminated water or soil. Domestic and wild animals act as reservoir hosts of infection, shedding leptospires from colonized renal tubules of the kidney, via urine, into the environment. The generation of mutant strains of Leptospira is critical to evaluate and understand pathogenic mechanisms of infection. CRISPR interference (CRISPRi) has proven to be a straightforward, affordable, and specific tool for gene silencing in pathogenic Leptospira. Therefore, the methodological details of obtaining the plasmid constructs containing both dCas9 and guide RNA, delivery of plasmids to Leptospira by conjugation with the E. coli strain &#946;2163, and transconjugant recovery and evaluation, will be described. In addition, the recently described Hornsby-Alt-Nally (HAN) media allows for the relatively rapid isolation and selection of mutant colonies on agar plates.

Application of CRISPR Interference CRISPRi for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

Here, the application of CRISPR interference (CRISPRi) for specific gene silencing in Leptospira species is described. Leptospira cells are transformed by conjugation with plasmids expressing dCas9 (catalytically "dead" Cas9) and a single-guide RNA (sgRNA), responsible for base pairing to the desired genomic target. Methods to validate gene silencing are presented.

レプトスピラの病原性種におけるCRISPR干渉(CRISPRi)の遺伝子サイレンシングへの応用

Leptospirosis is a global neglected zoonosis, responsible for at least 1 million cases per year and almost 60 thousand deaths. The disease is caused by ...