私の名前はジャラス・ナリーで、アイオワ州エイムズの国立動物病センターの研究チームの一員で、レプトスピラ症に取り組んでいます。レプトスピラ症は放置された病気です。それは世界的な病気です。
そして本当に、私たちはこれらのユニークな細菌グループが感染を引き起こす方法について非常に限られた理解を持っています。そこで本日のプレゼンテーションでは、CRISPR干渉と呼ばれる技術を用いて、レプトスピラによって発現される特定の遺伝子を特異的にサイレンシングすることによってレプトスピラ症の病原性メカニズムの評価を容易にする新しいツールの概要を提供する予定です。しかし、ニュートンコロニーを選択する能力は、これらの潔癖性レプトスピラに最良の成長培地を提供することに非常に依存している。
だから、まず第一に、私たちは非常に簡単にこれらの潔癖性細菌を伝播するために新しいメディアを導入したリック・ホーンズビーを紹介するつもりです。そして、レプトスピラ内の標的遺伝子を沈黙させるCRISPR干渉方法論について話すルイ・フェルナンデスをご紹介します。こんにちは、私はリック・ホーンズビーです。
100年以上前にアナダによって同定されて以来、レプトスピラは通常摂氏29度で単離され、伝播され、環境も哺乳類の宿主体温も反映していない。10年前、USDA ERSはレプトスピラメディアの改善の研究を開始し、この研究のうち、ホーンズビー-Alt-Nallyメディアが開発されました。このメディアを使用して、臨床医や研究者は、より迅速にレプトスピラを現場の症例から、および哺乳類の宿主をより密接にエミュレートする温度および環境での体外研究において、より迅速に分離し、伝播することができました。
私たちはこの培地を最適化し続けていますが、現状では、HANは、体外研究における獣医およびヒトの臨床隔離およびレプトスピラ症の予防のためのより効果的なワクチンの開発を大幅に改善する可能性を実証しています。こんにちは、私はルイ・フェルナンデスです。これまでのところ、レプトスピラ症の病因は、主に効果的かつ容易に遺伝的チューブを行うことがなかったため、未調査のままでした。
ここでは、CRISPR干渉またはCRISPRiと呼ばれる新しい技術について説明します。そして、この技術は、死んだCas9、またはdCas9と呼ばれる1つのDNA結合タンパク質と、シングルガイドRNAと呼ばれるキメラRNA分子の2つの成分を発現させる必要があるため、非常に簡単です。そして、複雑なdCas9とガイドRNAは、私たちのターゲット遺伝子に塩基対を作り、したがって転写を減らすか、あるいはブロックするつもりです。
また、新たに説明したHAN培地を用いることで、変異体回収のためのコロニー形成時間を大幅に短縮することができた。最初のステップは、ガイドRNAに含まれるプロトスペースを定義することです。この配列は、所望の遺伝子標的に対して塩基対を定義する20個のヌクレオチドを含む。
ヌクレオチド配列をウェブサーバーCHOPCHOPに提出し、レンサ球菌のピオゲネス、Cas9、およびプロトスペーサー隣接モチーフNGGに対して定義されたパラメータを使用します。結果に基づいて、マイナストレンド内で最高のスコアを持つプロトススペースを選択します。NGGモチーフは最終シーケンスに含まれません。
我々は、保存されたdCas9足場で5素数で可変20ヌクレオチドを含有する単導RNAを発現するためにlipL32プロモーターを使用してきた。カセットを取得した後、PMaOriに降格されます。Xma1 制限サイトの dCas9 プラスミド。
共役のためにレプトスピラ細胞は、HAN培地で摂氏29度または37度で増殖する。結合の1日前に、ドナー等分化細胞は、ジアミノピメル酸、DAP、およびスペクチノマイシンを補充したLB培地で増殖する。次に、結合の日に、LBプラスDAPで飽和した大腸菌培養物を焼く。
バイオセーフティフードの内部に、膜フィルターをガラスベースの上に置き、続いて15MLガラス漏斗を配置して濾過装置を組み立てた。両方の部分は、この春のクランプによって一緒に保持されています。次に、ガラスを真空ポンプに接続し、5 MLのレプトスピラ培養液を漏斗に加えます。
次に、目的のプラスミドを含む大腸菌ベータ2163株を加える。体積は、培養の光学密度に応じて変化する。1対1の細胞パイパーソンを目指しています。
真空ポンプを回すと、今、液体は膜を通過し、細胞はその上に集中します。フィルターを取り、EMJHプレートプラスDAP、バイキュリエ側に置きます。24時間摂氏29度でプレートをインキュベートします。
その後、プレートからフィルターを回収し、50 ML円錐管に配置します。液体HAN培地の1 MLを使用して、ピペット処理によってフィルターから細胞を回収する。暗視野顕微鏡で回収した細胞を可視化する。
この段階では、大腸菌とレプトスピラの同等の数が見られます。100~200マイクロリットルは、分光マイシンを含むHANプレートに細菌を広げるために使用されます。この段階では、DAP は省略され、大腸菌は成長しません。
プレートは摂氏37度と3%CO2でインキュベートされます。コロニーは8日から10日の間に明らかであるべきです。レプトスピラインターロガンコロニーは、視覚化するのが少し難しいです。
ここでは、それらを見やすくするために生い茂ったコロニーを示しています。100マイクロリットルの液体HANを、変異体を回収するための1.5 MLチューブに加える。各プレートから少なくとも3つのコロニーを取ることをお勧めします。
ピペットチップを使用して、個々のコロニーがプレートから取り出されます。アガーは単独で撮影される予定です。コロニーは、MTP PMaOriを含む制御プレートから採取する必要があります。
dCas9 プラスミド。そして、標的遺伝子用に設計されたdCas9およびガイドRNAの両方を有するプラスミドを含むレプトスピラを有するプレート。回収された細胞を暗視野顕微鏡下で可視化し、生存可能なレプトスピラの存在を確認できるようになりました。
脱液レプトスピラの可視化後、細胞をスペクチノマイシンを含む液体HAN培地に移す。培養後、細胞はサイレンシング確認および表現型評価のために回収できるようになった。標的タンパク質に対する抗体が利用可能な場合、イムノブロットはサイレンシングを評価するための簡単な方法論である。
pMAOriを含むレプトスピラ。dCas9単独、またはガイドRNA Casを用いてPCR、木材横取りプライマーにより評価される。DMTプラスミドは約300塩基対のバンドをもたらし、ガイドRNAカセットが存在すると約700の種類が達成される。
全細胞抽出物を用いた免疫ブロットは、サイレンシング確認のために行われ、この遺伝子を標的とするdCas9およびガイドRNAで発現したプラスミドを含む細胞においてlipL32タンパク質発現が廃止される。また、リンクaおよびリンクBの両方が、ガイドRNAを含む細胞には存在せず、両遺伝子に特異的である。コントロールlipL41は、すべてのレーンで見ることができます。
そこで、レプトスピラインターロガンにCRISPR干渉を使用しました, 我々はまた、レプトスピラのいくつかの追加の病原性種にそれを使用しています.私たちは、特定の遺伝子を沈黙させるだけでなく、小さな非コードRNAの発現を沈黙させるためにそれを使用してきました。私たちの研究の関心は、感染の病原性メカニズムを理解することにあるので、私たちは通常、分散因子を特定するために見ていますが、明らかにあなた自身の選択した遺伝子を沈黙させることができ、あなた自身の研究分野に応じて。
例えば、それは運動性やレプトスピラが環境中でどのように持続するか、または代謝を理解している可能性があります。いずれにしても、機能性ゲノミクスを実行し、問題の遺伝子の生物学的意義を理解できる特定の変異体を生成できるはずです。だから、国立動物病センターで私たち全員から、私たちはあなたの研究であなたに幸運を祈ります。
