このプロトコルでは、EcoHIV感染とTmem119-EGFPマウスの組み合わせが、HIV関連神経認知障害のげっ歯類モデルにおけるミクログリアの変化とウイルスリザーバーを調査するための貴重な生物学的システムを提供する方法について説明します。抗レトロウイルスの併用療法は、HIV陽性者の生活の質を劇的に改善しました。HIVが中枢神経系にどのような影響を与えるかを理解するためには、信頼性と実現可能性に優れたHIVのモデルが必要である。
これまでに、神経認知障害やシナプス機能障害を調べるために、ラットモデルを用いて、キメラHIVを用いた新しい生体システムであるEcoHIVをラットモデルで開発しました。EcoHIVの神経解剖学的分布、特に脳内のさまざまな細胞タイプでの差次的発現を明らかにするには、大きな課題が残っています。現在の研究では、mScarlet蛍光標識を施したEcoHIVを改変し、Tmem119-EGFPノックインマウスに眼窩後注射して、ミクログリアがウイルス発現に関与する主要な細胞タイプであり、脳内のHIVの貯蔵庫であるかどうかを判断しました。
まず、解離したラット胎児の脳細胞を、1ミリリットルのDMEM-F12と10%FBSを含むガラスインサートを備えたポリ-L-リジンプレコート12ウェルプレートに移します。細胞を摂氏37度で一晩、5%二酸化炭素とインキュベートします。翌日、培地をB27を補充したニューロベース培地と交換し、5%二酸化炭素を含む摂氏37度の細胞を3週間培養し続けます。
次に、60マイクロリットルのEcoHIV-mScarletを脳細胞培養物に加え、6日間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定します。特異的な一次抗体を用いて感染した脳細胞の免疫染色を行い、40倍対物レンズで共焦点顕微鏡でイメージングします。
ミクログリアは、ラット脳細胞培養における主要な感染細胞タイプとして同定され、mScarletとCD11b/cおよびIba1マーカーとの共局在によって証明されました。まず、首を切られた成体マウスの頭皮を開き、脳組織を5ミリリットルの滅菌HBSSを含む別のペトリ皿に移します。髄膜をはがし、前頭皮質を2ミリリットルのHBSSに移します。
次に、20マイクロリットルの0.25%トリプシン-EDTAを混合物に加えます。室温で15分間インキュベートし、数分ごとにチューブを渦巻かせます。解離した細胞を、10ミリリットルのDMEM-F12培地と10%FBSを含むポリ-L-リジンプレコート75平方センチメートルフラスコに移します。
摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターで細胞を90%の密度に達するまで培養します。次に、2ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAで脳細胞を消化します。消化した脳細胞を、5ミリリットルのDMEM-F12増殖培地が入った35mmのガラス底皿に、80%の密度に達するまで継代培養します。
次に、8マイクロリットルのEcoHIV-mScarletをマウスグリア細胞に加え、2日間インキュベートします。成体マウス初代グリア細胞は、2日間の治療後にEcoHIV-mScarletに感染することに成功しました。まず、麻酔をかけたTmem119-EGFPマウスを横向きの位置に固定します。
EcoHIV-mScarletを氷の上で解凍します。ウイルス溶液を33ゲージの鈍い針で眼内注射器シリンジに充填します。.頭を左に向けて、マウスを右側の横臥位に置きます。
目の周りの注射領域を特定します。針を眼の内側眼角にゆっくりと優しく挿入します。次に、針を眼球の後ろの血管に進めます。
6.5マイクロリットルのEcoHIV-mScarletを眼窩後洞に注入します。注射後、針を慎重に取り外します。麻酔をかけたマウスを化学ヒュームフード内の仰臥位に置きます。
胸部の正中線に沿って皮膚を開きます。次に、横隔膜を分離し、はさみで胸を開きます。次に、22ゲージの1本半の針を左心室に挿入します。
ハサミで右のアトリウムを開きます。50ミリリットルの予め冷却された100ミリモルPBSで右心房を灌流し、次に100ミリリットルの予め冷却された4%パラホルムアルデヒドで灌流します。マウスの脳全体を取り出します。
脳を4%パラホルムアルデヒドで固定した後、ビブラトームの金属プラットフォームに組織接着剤を使用して脳組織を固定します。.厚さ50μmの冠状切片を炭素鋼の刃で切断します。次に、ブラシを使用して脳のスライスをスライドガラスに置きます。
すぐに各セクションに0.1ミリリットルの退色防止封入剤を追加します。22 x 50ミリメートルのカバースリップを脳の部分に置き、スーパーフロストスライドを暗闇で1日間乾燥させます。翌日、波長488ナノメートルと594ナノメートルの共焦点顕微鏡を使用して、関心のある脳領域のマルチチャンネル画像を取得します。
EcoHIV-mScarletシグナルは、主にTmem119-EGFPマウス脳のEGFPで標識されたミクログリア細胞で観察されました。EcoHIV-mScarletで処理した培養ラット脳細胞では、有意な神経感染は検出されなかった。
