出生前イス^ルmnからのオキュロモータ、トロクレア、脊髄運動ニューロンの単離と培養 :GFPトランスジェニックマウス

これは、胚性マウスから一次眼および脊髄運動ニューロンを同時かつ効率的に精製し、培養する最初のプロトコルです。これは、運動ニューロン疾患の基礎となるメカニズムの研究を可能にする。このプロトコルは、既存のシステムに新しいインビトロ眼運動培養成分を追加し、比較のために純粋な種と年齢に一致した脊髄運動ニューロン培養を提供する。

筋萎縮性側索硬化症では、脊髄運動ニューロンは退化し、オキュロ運動ニューロンは比較的免れる。これらの文化を比較すると、疾患のメカニズムと治療に関する洞察を得ることができる。この方法は、運動ニューロンの発達、疾患、および選択的脆弱性の基礎となるメカニズムの研究を容易にする。

運動ニューロンの形態、分子生物学、電気生理学の特徴づけが可能な文化システムです。このテクニックを新しく使用する方には、多くの練習をお勧めします。解剖は技術的に困難であり、一次培養のための十分なニューロンを得るために複数の解離が必要な場合があります。

受精後約11.5日の妊娠中のマウスからIslet1 EGF陽性胚を収穫することから始めます。腹部にエタノールを十分にスプレーし、無菌マイクロ解剖ハサミと親指ドレッシング鉗子で子宮を取り除きます。生殖不能PBSで簡単に子宮を洗う。

その後、予冷された滅菌PBSで満たされた解剖プレートに移します。顕微鏡の明るい光の下で、マイクロディセクションはさみ、親指ドレッシング鉗子、およびデュモン5ピンセットを使用して子宮から胚を慎重に取り除く。その後、無菌モリアミニ穿張スプーンを使用して、各胚を1X V27で補った冷蔵ハイバネートE低蛍光培地で満たされた24ウェルプレートの別々のウェルに移します。

氷の上にプレートを維持しながら、滅菌解剖プレートに1つの胚を転送し、氷冷無菌ハンクのバランス塩溶液またはHBSSで完全にそれをカバーしています。ピンセットを使用して、中脳を損傷することなく、胚と尾の顔を取り除きます。その後、手足をまたがり、尾が顕微鏡の前に向かって指し示す胚を置きます。

小さな開口部を生成するために、4番目の心室の屋根を開いてスリットするためにピンセットを使用してください。この開口部を使用して、4番目の心室とその屋根の間に作成されたスペースにピンセットをフックします。胚の下部表面に沿って皮質に、横から床板とモーターカラムに分解する。

次いで、解剖された組織を開いた本の様式で開き、GFP陽性CN3およびCN4核を明らかにする。慎重に胚から腹側中脳を分離し、ピンセットとマイクロディセクショニングナイフで髄膜組織を除去します。両側GFP陽性CN3およびCN4核を床板および他のGFP陽性周囲組織から離れて解剖し、ニューロンに触れたり損傷を与えたりしないように注意を払う。

CN3とCN4の核を別々に採取する場合は、これら2つの核の中脳に沿って切断し、P1000ピペットを使用して、最小のHBSSで解剖された腹側中脳組織を収集する。解剖媒体で満たされたラベル付きの1.7ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに入れ、解離するまで氷の上にチューブを保管します。合計数が実験要件を満たすまで、同じチューブ内の追加の胚から腹側中脳を引っ張り続けます。

腹側脊髄を解剖するには、頭を顕微鏡の前に向けて胚を起こしやすい状態に保つ。ピンセットの1組でそれを保持し、4番目の心室の未開封の尾部に他のペアの先端を挿入します。後脳と脊髄の残りの部分を、胚の全体のロストロコーダル範囲をドーサリーに開きます。

第4心室から始まり、鉗子をはさみとして使用して尾突脊髄の中央運河に向かって働く側側組織を切断する。次に、ピンセットの1セットで胚を保持し、他のペアで両側の側の側組織のフラップをつまみます。マイクロディションナイフを使用して、両側の鋸のような動きで腹側脊髄を持ち上げるGFP陽性SMNの真下に突き刺すことによって、腹側脊髄を取り除きます。

脊髄を下肢の上縁部で横方向に切り、頸部腰部を取り除く。最初のGFP陽性前角が投影するC1の真上を横方向にカットします。腹側脊髄側を上に置き、GFP陽性SMNカラム間のGFP陰性組織をピンセットで押し付けて押し上げます。

GFP陽性SMNカラムの両側をマイクロ解離ナイフでトリミングして、残りの付いた間葉、DRG、および脊柱側を取り除きます。P1000ピペットを使用して、最小限のHBSSで解剖された腹側脊髄組織を収集し、解剖媒体で満たされたラベルの1.7ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに入れてください。解離するまで氷の上に保管し、同じチューブ内の追加の胚から腹側脊髄を引っ張り続けます。

分析された組織サンプルを含むマイクロ遠心分離管のそれぞれに適切な量のパパイン溶液を加えます。指をフリックして10分ごとにチューブを攪拌して30分間摂氏37度でチューブをインキュベートします。インキュベーション後、P200ピペットで各懸濁液を8回軽くトリチュレートし、300回gで5分間遠心分離します。

上下に軽くピペット処理を行い、適切な量のアルブミン・オボムコーイド阻害剤溶液で細胞ペレットを再懸濁する。遠心分離を繰り返します。P1000ピペットで上清を慎重に取り除きます。

適切な解剖媒体の中の細胞を再中断します。70マイクロメートルの細胞のストレーナーを通して懸濁液をフィルターします。次に、FACS ソートを使用して、CN3/CN4 および SMN から解剖した GFP 陽性細胞を単離します。

単離した細胞懸濁液を、適切な密度に摂氏37度にあらかじめ温めた運動ニューロン培養培地で希釈し、PDLラミニンコーティング96ウェルプレートのウェルに200マイクロリットルの懸濁液を加えます。5日ごとに運動ニューロン培養培地をリフレッシュするように、37°Cと5%の二酸化炭素インキュベーターでニューロンを培養する。正常に単離されたニューロンが培養で成長した場合、ほぼ純粋な一次CN3/CN4およびSMN培養物が得られ、14日間インビトロで維持された。

インビトロでの2日間の培養物の純粋度は、運動ニューロンマーカーIslet1および神経マーカーTUJ1を用いて免疫細胞化学によって評価された場合、CN3/CN4で93.5%、SMNで86.7%であった。純粋性は、胚の年齢とFACS中のGFPゲートの適切な閾値の設定に大きく依存していた。E10.5胚から単離されたニューロンの純度はE11.5胚の純度と同等であった。

しかし、E13.5胚を使用した場合、純度は大幅に低下した。一次CN3/CN4sおよびSMNsが小胞体ストレッサーに対して差動応答を示したかどうかを判断するために、細胞は2日間のインビトロでシクロピアゾン酸またはCPAの様々な濃度で処理され、免疫細胞化学が生存率を評価するために3日後に固定された。各サンプル中の生存ニューロンの数をカウントし、生存率を計算した。

CN3/CN4単一培養は、SMN単一培養と比較してCPA治療に対して有意に耐性があった。この手順に従って、多くの追加の方法を実行して運動ニューロンを調べることができます。いくつかの例には、電気生理学、細胞生物学、転写、またはクロマチンのアクセシビリティの研究が含まれます。