この研究では、LDLRノックアウトマウスの大動脈弓と根のアテローム性動脈硬化症病変の発達を調査し、アテローム性動脈硬化症の重症度プラーク組成を評価するための分離、染色、および分析のためのプロトコルを提供します。この研究で使用された組織学的検査に加えて、アテローム性動脈硬化症を評価するための実用的な技術には、生化学的マーカー、分子生物学的検査、および血管超音波も含まれます。解剖手順の精度は、アテローム性動脈硬化症のマウスモデル内でin vivo大動脈ストリッピングを行う際に最大の技術的ハードルをもたらします。
まず、安楽死させたマウスを仰臥位にして、1〜2層の吸収紙で覆われた発泡スチロールボードの上に置きます。手足をピンで固定して体を安定させます。マウスの腹部に75%エタノールをスプレーして、毛皮をきれいにし、湿らせます。
鉗子を使用してマウスの腹側皮膚をつかみます。次に、細いはさみを使用して、腹部の付け根から首の上部まで皮膚を切り取ります。腹壁を開き、鉗子を使用して胸骨を持ち上げます。
横隔膜と肋骨の両方を切開して、胸腔を露出させます。食道と気管を切除して、頸動脈の洗浄を容易にします。腎臓と腹部大動脈を温存しながら、肝臓、肺、脾臓、胃腸管、膵臓などの臓器を慎重に切除します。
腸間膜動脈を解剖するときは、損傷を避けるために腸を持ち上げ、大動脈から離して切開を行います。次に、マウスを実体顕微鏡の下に置き、明確な観察フィールドを提供し、冷光源を解剖領域に合わせます。PBSを充填した10ミリリットルのシリンジを使用して、針で左心室頂点にゆっくりと注入し、大動脈の拡張を観察します。
解剖部の血液や体液をティッシュペーパーでやさしく拭き取り、視野を十分に露出させます。次に、胸部大動脈の横隔膜部分を鉗子でつかみ、スプリングハサミで大動脈と胸部筋壁の間の結合組織を切断します。鉗子で心臓をやさしく引っ張り、胸部大動脈を持ち上げます。
大動脈弓の枝を観察し、大動脈弓の周りの外膜脂肪と結合組織、および胸部大動脈に沿って上向きに枝を解剖します。腹部大動脈と総腸骨動脈を胸部大動脈に沿って下向きに解剖します。心臓組織をトリミングし、心房に平行な平面に沿って心臓の下半分を切断し、トリミングした心臓を適切な記憶媒体に入れます。
大動脈弓を解剖する前に、コントラストを作成するために、その下に小さな暗い色のガスケットを置きます。大動脈弓領域の写真を撮ります。総腸骨動脈を分岐部の1〜2ミリメートル下に切断し、脊椎に沿って大動脈の小さな枝をトリミングして解放します。
腎臓近くの腎動脈を切り離した後、首の3つの枝血管を遠位端から切り取ります。最後に、心臓の近くの上行大動脈を切断します。あらかじめ1.5ミリリットルの遠心分離管に4%パラホルムアルデヒド溶液を1ミリリットル調製してください。
準備したチューブに大動脈を留置し、室温で少なくとも24時間固定します。次に、PBSが入ったシャーレに大動脈を移し替えて、乾燥を防ぎます。実体顕微鏡下で、鉗子とスプリングハサミを使用して残っている外膜脂肪を慎重に取り除き、プラーク定量への干渉を減らします。
スプリングハサミを使用して、大動脈の内側の縦軸に沿って慎重に切り開きます。順番に、大動脈弓の3つの枝を外側に沿って大動脈弓の湾曲のレベルまで切り開き、大動脈弓が完全に広がるようにします。この段階では、オイルレッドO染色を進めるか、将来の分析のために大動脈を4%パラホルムアルデヒドに保存します。
カットオープン大動脈を6ウェルプレートに入れます。各ウェルに1ミリリットルの滅菌二重蒸留水を加え、シェーカーで5分間洗浄します。6ウェルプレートをドラフトに置き、目に見える透かしがなくなるまで20分間風乾します。
各ウェルに1ミリリットルの新しく調製したオイルレッドO作業溶液を追加します。プレートを20分間振とうした後、オイルレッドO溶液をウェルから取り出します。各ウェルに2ミリリットルの滅菌二重蒸留水を加え、5分間洗浄します。
3回の洗浄後、大動脈を二重蒸留水に保管します。大動脈をスライドに移し、スライドの下に黒いゴムパッドを置いてコントラストを高めます。実体顕微鏡で見ながら大動脈を広げます。
次に、スライドを白い紙の上に置いて、コントラストをさらに強化します。スライドの横に定規を置き、カメラで写真を撮ります。処理した大動脈は、1ミリリットルのPBSが入った1.5ミリリットルの遠心分離チューブに保管して、湿った状態を保ちます。
ウエスタンスタイルの食事を与えられたLDLRノックアウトマウスの体重は、チャウダイエットを与えられたマウスと比較して有意に増加しました。血漿トリグリセリドと総コレステロール値は、対照群よりも西洋式ダイエット群で有意に高かった。大動脈油レッドO染色は、ウエスタン型食餌を与えられたLDLRノックアウトマウスの動脈に重度の脂質蓄積を示した。
脂質沈着物の増加は、より重篤なアテローム性動脈硬化病変と相関していた。大動脈根病変領域と壊死性コアは、西洋型食餌を与えられたマウスでは、チョウ飼料を与えられたマウスと比較して有意に大きかった。大動脈根病変領域と壊死領域の定量化により、西洋型食餌がLDLRノックアウトマウスのアテローム性動脈硬化性プラーク形成を悪化させることが確認されました。
