NIHの助成金P20 RR16440のサブプロジェクトと研究と大学院教育のウェストバージニア大学のオフィスからS.ウィードへのブリッジの助成金によってサポートされています。プロジェクト開発の初期段階におけるL.ロペス-スキナーからの技術支援を感謝する。 P.ターナーとK.セクレスト（ウェストバージニア大学部の、作者はまた、テクニカルサポートおよびJ.マイヤーズとM. Younesさん（頭頸部外科、MDアンダーソンがんセンター、ヒューストン、テキサス州）からOSC19細胞に感謝しています組織学的処理と手順については、病理組織バンク）、pLL7.0レンチウイルスベクターのためのLifeAct - mCherry構造とJ.ベア（ノースカロライナ大学）のためのR. Wysolmerski（ウェストバージニア大学、神経生物学と解剖学講座）。ウェストバージニア大学の顕微鏡イメージング施設（NIHの助成金P20 RR16440とメアリーバブランドルフがんセンターでサポートされている）とその非線形光学顕微鏡の実験室（NLOMの使用、神経科学のためのウェストバージニア大学センターとの間のジョイントコラボレーションによってサポートされていると物理学/ウェストバージニア州ナノイニシアティブのウェストバージニア大学部）にも感謝です。 NLOMは、神経科学のためのセンターにNIHの助成金P30 RR031155によって部分的にサポートされています。

1。細胞株、ベクターの構築およびレンチウイルス生産<ol><li>人間の頭頸部の腫瘍細胞株は、（OSC19またはUMSCC1）10％ウシ胎児血清FBS（Hycloneの猫＃SH30070.03）、1％ペニシリンを添加した（Cellgroの猫＃50 - 003 - PB）DMEMから成る、完全な培地で培養された/ストレプトマイシン（Cellgroの猫＃30 - 002 - CI）、および1％非必須アミノ酸（Cellgroの猫＃25 - 025 - CI）。 </li><li> pLL7.0レンチウイルスベクターにLifeAct - mCherryコード配列を転送するには、cDNAの親mCherryでSbf1認識部位は、部位特異的突然変異誘発（ストラタジーン社製の猫＃200518〜5）を使用して、認識配列に3つのサイレント変異を導入することによって変更されました。その結果修正されたLifeAct - mCherryのシーケンスは、PCRはEcoR1/Sbf1サイトに隣接して増幅し、pLL7.0 - LifeAct - mCherry構築を生成するためにpLL7.0にサブクローニングした。 </li></ol> 2。 pLL7.0 - LifeAct - mCherryのウイルス産生<ol><li>ウイルス産生は、レンチウイルス発現システムマニュアル（システムバイオサイエンスバージョン2から051018）に基づいて行われました。 </li><li>パッケージング細胞株293T/17細胞（ATCCカタログ番号CRL - 11268）HNSCC線に使用したのと同じ完全培地中40％コンフルエンスまで増殖させた。 </li><li>細胞はそれぞれ（クロンテックの猫＃631312）CalPhosを使用して、pLL7.0 - LifeAct - mCherry、psPAX2、そして3時02分01秒の比率でpVSV - Gベクターをトランスフェクションした。 </li><li> 24時間後、トランスフェクションからの最初のメディアは、新鮮な培地に交換した。 </li><li>メディアは、その後回収と補充、12時間ごとに72時間、4℃で保存した</li></ol> 3。安定LifeAct - mCherry発現と頭頚部の細胞株の産生<ol><li>収集されたメディアは、4℃で10分間2000rpmで回転させた℃で</li><li>ウイルスを含む明らかにメディアの一mlを直接12時間OSC19またはUMSCC1細胞に添加した。次いで、細胞をリンスした、とウイルスの追加の1枚のMLは、別の12時間内の追加されました。 </li><li>細胞は耐性コロニーを選択するために2週間200mg/mlピューロマイシンを含む培地で処理した。 </li><li>生き残ったクローンは、蛍光顕微鏡でLifeAct - mCherry発現のために視覚的にスクリーニングした。個々の陽性コロニーを滅菌した3ミリメートルクローニングディスク（フィッシャーの猫＃0790710A）を使用してtypsinizedした。 </li><li>陽性細胞は、バック凍結または同所性注入に使用するまで200mg/mlピューロマイシンを含む培地で維持した。 </li></ol> 4。同所性腫瘍異種移植片の形成<ol><li>すべての動物の手順は、ウェストバージニア大学の動物実験委員会によって承認されたプロトコール（09〜0821）に準拠して実施された。 </li><li> LifeAct - mCherry発現する腫瘍細胞は、トリプシン処理、遠心分離し、2.5 × 10 4個の細胞を50μL完全培地に再懸濁したれた。 </li><li>腫瘍細胞は27 ½ゲージの注射針に接続された1ミリリットルの注射器に充填した。 </li><li>女性の無胸腺Fox1 nu / nuマウス8週齢（ハーランラボラトリーズは）ケタミン及び10mg/kgより少ないキシラジンを80mg/kgの組み合わせで麻酔した。麻酔したマウスは、加温パッドに37〜40 ° Cの間で維持された。 </li><li>滅菌ピンセットを用いて、舌の先端を穏やかに把握し、慎重に口腔内から引き出された。 </li><li>細胞は徐々に舌動脈を避けて、舌の中心部に球根状の塊を作成するために、各舌の片側に注入した。 </li><li>マウスは、2.1mg/kgのヨヒンビンを注入し、それらが麻酔からの回復中に2〜3時間のために監視されたヒーティングパッドに戻された。 </li><li>一度復活、マウスはソフトトランスジェニック生地の食（Bioserveの猫＃S3472）を含む滅菌ケージに入れた。 </li><li>マウスは2〜3日ごとに秤量して、腫瘍の発症のために視覚的にモニターした。 </li></ol> 5。 生体外イメージングのためのマウスの舌の準備<ol><li>異なる時点（通常は2週間から4週間後の注射）で腫瘍を保有するマウスは、二酸化炭素の吸入によって安楽死させた。 </li><li>舌は、抽出1X PBSでリンスし、地元のホビーショップやサイズ8縫針からモノフィラメント糸を使用して、従来のパラフィン組織包埋カセットの片側（StatLab猫＃H104、）に添付された。 </li><li>舌が固定化された後は、全体のカセットのアセンブリは、30ミリメートル組織培養皿に置かれ、1X PBSで浸漬した。 </li><li>処理された舌はすぐに2光子励起顕微鏡を使用した。 </li></ol> 6。二光子顕微鏡による舌腫瘍のイメージング<ol><li>舌のカセットは正立顕微鏡（;サターインスツルメンツ可動顕微鏡（MOM））の目的の下に配置引き込み式のカンチレバーアーム（商工会議所シャトル、シスキユー楽器）にカスタム設計されたホルダーに固定1X PBSを含む60ミリメートル皿に浸漬した。 </li><li> 40X/0.8NAの水浸対物レンズを直接目に見えるタム上または覆うように配置されたまたは病変。サファイアレーザー（ミラ、コヒーレント）60 MWを755 nmの入力波長での強度mCherry信号を最適化する：舌は、Tiとの二光子顕微鏡で画像化した。 </li><li>シリアル1ミリメートルのレーザースキャン画像は、15と100μm（腫瘍体積に応じて）の間の総組織の深さ以上1μmの増分の深さで採取された。画像はscanimage、カレルヴォ研究所（Janeliaファーム、HHMI）が開発したMATLABのプラットフォームをベースとしたオープンソースのプログラムを使用して捕獲された。 scanimageでもは、x / yガルバノスキャンミラーを制御するためにラスタスキャンパターンの2チャンネルの出力を生成し、同時に（PCI - 6610Sのデータ収集ボードを介して光電子増倍管（光電子増倍管）から同時に最大4チャンネルの信号の入力をキャプチャ、ナショナルインスツルメンツ）。 PMTの信号はモニター画面に表示するためにNI - DAQボードに供給する前に、低ノイズ電流のプリアンプ（SR570、スタンフォードリサーチシステム）により増幅される。 scanimageでも、客観的のz軸を制御することにより、Zスタック画像を収集し、単一またはサイクルモードでのタイムラプス画像を収集します。画像は16ビットの深さを持つ単一のTIFFファイルに保存されていました。 </li></ol> 7。アミラのソフトウェアを使用して、画像解析<ol><li>腫瘍定量のためのアミライメージング：Aimraのソフトウェアでは、Zスタック画像のセットを含むTIFFファイルを開きます。 </li><li>ファイル名を強調表示し、三次元レンダリングを生成するためにVoltex機能を選択して適用。総称して浸潤細胞のいくつかの小さな、解離侵襲グループ（IG）を持つ大規模な原発腫瘍の画像は、レンダリングされた画像（図6Aを参照）で典型的に明らかである。 </li><li>原発腫瘍の塊を選択し、次に&quot;ラベルフィールド&quot;、&quot;ラベル&quot;、&quot;オープンデータ&quot;を選択します。 </li><li>主な閾値すべてのZスタック画像を腫瘍には、選択して三次元の中で唯一の原発腫瘍塊を含めることを確保するためにz -平面の画像をスクロールします。これは通常、フィールドの最大サイズの画像であり、画像化されたが、z -平面を介して走査されたときに、多くの場合、セグメント化されます。 </li><li>腫瘍信号のいずれかをバックグラウンド蛍光を修正し、破棄することなく、画像からそれを排除するために魔法の杖/しきい値関数を使用してください。 &quot;内部ファイル&quot;のラベルをハイライトし、⊕のボタンをクリックします。 &quot;すべてのスライス&quot;のチェックボックスを選択します。これは、すべてのZスタックインクリメントの閾値原発腫瘍領域の周囲に色付きの境界線を生成します。 </li><li> IGSを選択するには、&quot;新しい&quot;機能を選択してください。単一のIGを選択して、z平面のスクロールでは、原発腫瘍に関連付けられていないことを確認してください。 </li><li> &quot;すべてのスライス&quot;を選択し、⊕のボタンをクリックします。ファイル（：IG 1 EX）の名前を変更</li><li> 7.4閾値処理手続きと決定IG 7.5のハイライト手順を繰り返します。原発腫瘍の塊を示すために使用される色とは異なる輪郭の色を選択します。 </li><li> IGSが示されているすべてを確実にするためにz -平面をスキャン、画像全体の各追加IGのため、必要に応じて手順を繰り返します。画像上で将来の識別で特定された各IGエイズのために異なる色を使用した。 </li><li>原発腫瘍と、すべてのIGSを選択したら、プルダウンメニューから&quot;セグメンテーション&quot;を選択し、&quot;素材の統計&quot;を選択します。これは、ボリュームの測定だけでなく、X、YとXの腫瘍の中心は、腫瘍の点から、IGSの距離を計算するために、原発腫瘍の座標を提供します。 </li><li>計算されたボリュームで、原発腫瘍の中央のコアから各IGの距離を決定する。その後、&quot;セグメンテーション&quot;、&quot;マテリアルの統計&quot;を選択してください。このステップでは、ピクセルにすべての測定値を計算します。顕微鏡対物と倍率の任意の追加増加（;ズーム機能すなわち）のキャリブレーションに基づいて、マイクロメートルにピクセルを変換します。顕微鏡およびこれらの実験で使用した設定については、40倍目標は1ピクセル= 0.298μmのキャリブレーションを与え、無ズームで使用されました。三次元での原発腫瘍（X1、Y1、Z1）と各IGのパラメータを与える（最初のIGのためのX2、Y2、Z2例）Excelスプレッドシートにデータをインポートします。 </li><li>原発腫瘍の中心から各IG用ミクロンの侵攻の距離は、式√を（（X2 - X1）2 +（Y2 - Y1）2 +（Z2 - Z1）2）を使用して計算されます。 </li><li>腫瘍浸潤性指数は、（T I）式T I = N T X V T ×奥行T、N、T =画像のIGSの合計数、V T =すべてのIGSの合計量、D Tを使用して計算されます=総走行距離は、原発腫瘍の中心部からすべての侵襲的なグループの旅。 </li></ol> 8。ニコンNIS - Elementsシリーズはソフトウェアと三次元のレンダリング<ol><li>より地形ディテールを持つ3つの次元のレンダリングは、ニコンNIS - Elementsシリーズはソフトウェアに腫瘍全体のイメージの元の16ビットのモノクロTIFFファイルをインポートして生成することができますパッケージ（ニコン、メルヴィル、ニューヨーク州）。その後、&quot;ND&quot;、&quot;File&quot;を選択し、次に&quot;ファイルのシーケンスからNDファイルを作成します&quot;。 TIFF Zシリーズの画像スタックを選択し、適切なステップサイズを指定します。 </li><li> xy平面上のNDの文書を校正します。マニュアルキャリブレーションを使用して1つのピクセルのサイズを指定します。 </li><li> &quot;ボリュームの表示&quot;を選択します。より高い品質に対してz平面上の追加のスライスを計算するために&quot;HQ&quot;機能を使用してください。 &quot;3Dレンダラー設定&quot;で、&quot;超高詳細&quot;と&quot;フル解像度&quot;の品質で&quot;高度なレンダラ&quot;を使用。腫瘍表面を強調する&quot;アルファブレンディング&quot;を選択します。 </li><li>プレゼンテーションのための三次元画像を最適化します。必要に応じて腫瘍と関連するIGSと作物上でズーム。のxyz平面内で画像を回転させるとLUTを調整する。 </li><li>プレゼンテーション用のイメージをキャプチャします。 &quot;編集​​ - ビューの作成スナップショットを（8ビットRGB）&quot;を選択します。それに応じてファイルに名前を付けて保存します。 </li></ol> 9。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。同所舌の腫瘍の生産とその場二光子イメージングの主要なステップを示す全体概略図。 <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig2.jpg" alt="図2" /> 図2マウスの舌にOSC19発現細胞LifeAct - mCherryの注入。 <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig3.jpg" alt="図3" /> 図3切除腫瘍を含むマウスの舌は、2光子イメージングのための準備。 <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。イメージングのための準備ができて二光子顕微鏡の位置で腫瘍を含む舌のオリエンテーション。 <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。scanimageでも、初期の二光子画像の生データの取得を証明するから撮影代表画面。 <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig6.jpg" alt="図6" /> 図6。同所OSC19の腫瘍の画像解析と腫瘍浸潤の定量化。アミラVoltexのレンダリング（）と単閾値のz -セクションの代表的なスクリーンショットの画像（B）青で概説紫、侵襲性グループ1（IG - 1）に記載されている主な原発腫瘍と、赤とIGに記載されているIG - 2 -3は、識別の手順の例として、緑色で概説。矢印がでIGSを表す（A）と（B）。ボリュームのC.プロットに対する腫瘍浸潤のインデックス（Ti）を計算するために使用される8個々のIGSの距離を侵略した。 <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig7.jpg" alt="図7" /> 図7。腫瘍の代表画像は、従来のIHCのアプローチからの画像と比較して、このプロトコルの腫瘍グループを侵略した。UMSCC1同所腫瘍を保有する全体のマウスの舌のA.パラフィンセクション。免疫組織化学的染色は、HNSCC特異的細胞マーカーEMMPRIN（Zymed社、猫＃34〜5600）に対する一次抗体で、従来の手順を用いて実施された1:1000希釈でとOmniMap DAB抗Rbの検出キット（Ventanaの猫＃760を使用して可視化-149）は鉄ヘマトキシリン​​染色が続く。総舌領域を包含する画像はオプトロニクスMicroFire CCDカメラでオリンパスZX70プロビス顕微鏡で4Xの倍率で個別に収集し、StereoINvestigatorイメージングパッケージを（MBFバイオサイエンス）を用いて再建された。腫瘍は舌の先端で明らかである。侵襲的なフロントおよび個々の腫瘍細胞群（矢印）を示す拡大地域は、代表的なOSC19の腫瘍の（B）。C.ニコンNIS - Elementsのレンダリングで表示されます。強化された輪郭の詳細とIGSの明確な可視化（矢印）が明らかである。すべての画像のバー= 100μmの。

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	<li>Sano, D., Myers, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+models+of+head+and+neck+cancers.">Xenograft models of head and neck cancers.</a> Head Neck Oncol. 1, 32-32 (2009).</li><li>Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+cancer+in+the+head+and+neck+region.">Animal models of cancer in the head and neck region.</a> Clin Exp Otorhinolaryngol. 2, 55-60 (2009).</li><li>Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+nude+mouse+model+of+oral+tongue+squamous+cell+carcinoma.">An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma.</a> Clin Cancer Res. 8, 293-298 (2002).</li><li>Sano, D., Myers, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+tongue.">Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue.</a> Cancer Metastasis Rev. 26, 645-662 (2007).</li><li>Sano, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+combination+anti-endothelial+growth+factor+receptor+and+anti-vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+targeted+therapy+on+lymph+node+metastasis:+a+study+in+an+orthotopic+nude+mouse+model+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+tongue.">The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135, 411-420 (2009).</li><li>Kupferman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+induces+EMT+and+has+a+key+role+in+invasion+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">TrkB induces EMT and has a key role in invasion of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oncogene. 29, 2047-2059 (2010).</li><li>Ammer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saracatinib+Impairs+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Invasion+by+Disrupting+Invadopodia+Function.">Saracatinib Impairs Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Invasion by Disrupting Invadopodia Function.</a> J Cancer Sci Ther. 1, 52-61 (2009).</li><li>Rosenthal, E. L., Kulbersh, B. D., King, T., Chaudhuri, T. R., Zinn, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorescent+labeled+anti-epidermal+growth+factor+receptor+antibody+to+image+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+xenografts.">Use of fluorescent labeled anti-epidermal growth factor receptor antibody to image head and neck squamous cell carcinoma xenografts.</a> Mol Cancer Ther. 6, 1230-1238 (2007).</li><li>Gleysteen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeled+anti-EGFR+antibody+for+identification+of+regional+and+distant+metastasis+in+a+preclinical+xenograft+model.">Fluorescent labeled anti-EGFR antibody for identification of regional and distant metastasis in a preclinical xenograft model.</a> Head Neck. 30, 782-789 (2008).</li><li>Bhirde, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+killing+of+cancer+cells+in+vivo+and+in+vitro+with+EGF-directed+carbon+nanotube-based+drug+delivery.">Targeted killing of cancer cells in vivo and in vitro with EGF-directed carbon nanotube-based drug delivery.</a> ACS Nano. 3, 307-316 (2009).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

同所性マウスモデルでは、頭頸部癌の1,2の多くの側面を研究するために有用であることが証明されている。私たちは、頭頸部腫瘍細胞の浸潤の初期の事象を研究するためのシステムとしてmCherry -標識細胞の二光子顕微鏡イメージングとSCOT 3の十分に確立された同所のシステムを組み合わせている。この手順では、我々は細胞が特に不足して舌の大きさのためにマウスの6週間若いに、腫瘍注射部位から漏れることができることに留意している。我々はこの問題を回避するためにそれ以上の年齢のマウスを使用してください。それ以上の年齢のマウスでより大きな舌の大きさにも舌から舌動脈と過度の出血の破裂を避けるためにも役立ちます。舌が飛躍的に最初の注射部位での膨潤時に腫瘍のテイクが大幅に強化されています。注入液が吸収されるので、これは一から二時間以内におさまるの腫れ。腫瘍の成長は、舌の表面に小さな白いバンプとして指示された注入さ細胞数で明らかに1〜2週間後に注射をされます。我々はまた、ここで紹介私たちの研究で使用されている40X目的で、我々は個々の腫瘍細胞を区別することはできませんが、HNSCC侵入の典型的なモードを再現侵襲的な細胞クラスターとしてIGSを識別することにも注意してください。 このモデルを今日まで広範囲に監視さ頸部リンパ節転移により測定された効果は、IHCまたは生物発光の方法4-7を使用して、SCOT成長上の特定の分子だけでなく、いくつかの抗腫瘍薬の役割侵入をテストするために使用されています。腫瘍は浸潤性多細胞クラスターとしてその場で画像全体の腫瘍への二光子顕微鏡の応用を可能にする、近い舌の表面（図7）にこのシステムのマニフェストに形成。手順は、携帯電話の解像度と腫瘍浸潤を可視化するために利用することができます。二光子顕微鏡は、以前は同所8,9および異種移植8,10モデルで頭頸部癌のための実験的な治療法を研究するために利用されている。しかし、これらの報告と我々のプロトコルには、2つの大きな違いがあります。最初に、これらの研究はおそらく循環への十分なアクセス権を持つ唯一の腫瘍細胞に検出を制限し、頭頸部腫瘍細胞を標的/識別するために、細胞外のラベルを使用してください。早期の転移活性は、実験パラメータとして評価されていない可能性が反復することに近いプライマリサイトへの腫瘍細胞の第二、侵略。我々のプロトコルは、直接マウスの舌に腫瘍の進行中の任意の時点で腫瘍細胞の浸潤を定量化する機能を提供します。ここで説明する方法は解剖舌を使って手順を説明しながら、我々は、同時に初期の浸潤、局所リンパ節転移との遠隔転移を監視するために生物発光との組み合わせで使用するための生きたマウスで画像の腫瘍の浸潤にこの方法を適応させるプロセスで、現在です。同じ動物。 in vivoイメージングのためのプロトコルへの変更は撮像中にマウスを配置し、維持するための適切な段階だけでなく、適切に画像処理手順の実行中に麻酔したマウスの口腔内を灌漑するための実用的なシステムの設計が必要です。一度に最適化された、これらの適応は、潜在的なプロ侵襲的分子とテスト抗浸潤局所浸潤に対する化合物および拡張期間にわたって動物のより多くの遠隔転移の関与の役割を研究する能力を提供します。

multi-photon imaging of tumor cell invasion in an orthotopic mouse model of oral squamous cell carcinoma

局所領域頭頸部癌の浸潤、転移のリスクにリンクされ、患者管理戦略の設計および実装の困難な課題を提示しています。口腔癌の同所性マウスモデルは、インパクトの侵略その要因の研究を促進し、抗腫瘍治療薬を評価するためのモデルシステムとして開発されている。これらのシステムでは、口腔組織内播種性腫瘍細胞の可視化では、通常、従来の組織型によってまたは in vivo生物発光の方法でと行われてきた。これらの技術の主な欠点は、正確に三次元でのプライマリサイトに起因する初期の腫瘍細胞の浸潤を可視化し定量化するための固有のできないことです。ここでは、舌腫瘍の広がりのマルチベクトル可視化を可能にするために二光子イメージングと舌の扁平上皮癌（SCOT）のための確立されたモデルを組み合わせたプロトコルについて説明します。 OSC - 19頭頸部腫瘍細胞株は安定的にmCherry蛍光タンパク質（LifeAct - mCherry）に融合した、F -アクチン結合ペプチドのLifeActを発現するように設計されました。これらの細胞を注入Fox1 nu / nuマウスでは、確実に舌が二光子顕微鏡の生体外のアプリケーションによって可視化するための腫瘍を形成。この手法は、腫瘍塊の同所性可視化を可能にし、局所的に地域の腫瘍の微小環境を中断することなく、切除された舌の細胞に侵入。さらに、このシステムは、原発腫瘍部位から細胞の移動を侵略した距離を計算することにより腫瘍細胞の浸潤の定量化が可能になります。全体的にこの手順では、SCOTの浸潤や局所浸潤や遠隔転移拡散を防止するために合わせた治療的処置に寄与する要因を分析するための拡張されたモデルのシステムを提供します。また、このメソッドは、最終的にin vivoでの設定での他の画像診断法と組み合わせることが可能性を秘めています。

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

標識された細胞の多光子顕微鏡を通して舌内に口腔癌と腫瘍浸潤の定量的なモニタリングのマウスモデルの生成に関わる技術の包括的な概要が表示されます。このシステムは、抗浸潤化合物の分子の評価と薬効のための有用なプラットフォームとして機能することができます。

口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

multi-photon-imaging-tumor-cell-invasion-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Medicine

18.9K ビュー.  Mary Babb Randolph Cancer Center, West Virginia University. 標識された細胞の多光子顕微鏡を通して舌内に口腔癌と腫瘍浸潤の定量的なモニタリングのマウスモデルの生成に関わる技術の包括的な概要が表示されます。このシステムは、抗浸潤化合物の分子の評価と薬効のための有用なプラットフォームとして機能することができます。

ビデオ: Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

マウス膀胱癌の同所性モデル

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

医学

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

同所性マウス脳腫瘍モデルのコンビネーション放射線治療

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

モデリングとイメージング、3次元の集団細胞浸潤

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

同所性膀胱腫瘍モデルと膀胱内Sarnaの治療の評価

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

甲状腺未分化癌の同所性マウスモデル

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

同所神経膠芽腫モデルマウスは、脳実質細胞の物理的制約を維持し、生体内二光子顕微鏡に適し

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the cornea, which can be caused by trauma, keratoplasty or infectious disease, breaks down the so called &lsquo;angiogenic privilege' of the cornea and forms the basis of multiple visual pathologies that may even lead to blindness. Although there are several treatment options available, the fundamental medical need presented by corneal neovascular pathologies remains unmet. In order to develop safe, effective, and targeted therapies, a reliable model of corneal NV and pharmacological intervention is required. Here, we describe an alkali-burn injury corneal neovascularization model in the mouse. This protocol provides a method for the application of a controlled alkali-burn injury to the cornea, administration of a pharmacological compound of interest, and visualization of the result. This method could prove instrumental for studying the mechanisms and opportunities for intervention in corneal NV and other neovascular disorders.

Neovascularization (NV) of the cornea can complicate multiple visual pathologies. Utilizing a controlled, alkali-burn injury model, a quantifiable level of corneal NV can be produced for mechanistic study of corneal NV and evaluation of potential therapies for neovascular disorders.

マウス角膜血管新生のアルカリ熱傷損傷モデル

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection of E6/E7 mRNA by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) requires RNA extraction which destroys the tumor tissue context critical for morphological correlation and has been difficult to be adopted in routine clinical practice. Our recently developed RNA in situ hybridization technology, RNAscope, permits direct visualization of RNA in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue with single molecule sensitivity and single cell resolution, which enables highly sensitive and specific in situ analysis of any RNA biomarker in routine clinical specimens. The RNAscope HPV assay was designed to detect the E6/E7 mRNA of seven high-risk HPV genotypes (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58) using a pool of genotype-specific probes. It has demonstrated excellent sensitivity and specificity against the current &#39;gold standard&#39; method of detecting E6/E7 mRNA by qRT-PCR. HPV status determined by RNAscope is strongly prognostic of clinical outcome in oropharyngeal cancer patients.

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

The presence of high-risk HPV in head and neck tumor tissue is associated with favorable outcomes. The recently developed RNA in situ hybridization technique called RNAscope allows direct visualization of HPV E6/E7 mRNA in FFPE tissue sections.

用RNAscope<em&gt;その場で</em&gt;ヘッドの転写的に活性なヒトパピローマウイルスの検出および頸部扁平上皮癌

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

Dynamic Contrast Enhanced Magnetic Resonance Imaging of an Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe respiratory motion artifact in the abdominal area. Orthotopic tumor models offer advantages over subcutaneous ones, because those can reflect the primary tumor microenvironment affecting blood supply, neovascularization, and tumor cell invasion. We have recently established a protocol of DCE-MRI of orthotopic pancreatic tumor xenografts in mouse models by securing tumors with an orthogonally bent plastic board to prevent motion transfer from the chest region during imaging. The pressure by this board was localized on the abdominal area, and has not resulted in respiratory difficulty of the animals. This article demonstrates the detailed procedure of orthotopic pancreatic tumor modeling using small animals and DCE-MRI of the tumor xenografts. Quantification method of pharmacokinetic parameters in DCE-MRI is also introduced. The procedure described in this article will assist investigators to apply DCE-MRI for orthotopic gastrointestinal cancer mouse models.

The goal of this protocol is to apply dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) for orthotopic pancreatic tumor xenografts in mice. DCE-MRI is a non-invasive method to analyze microvasculature in a target tissue, and useful to assess vascular response in a tumor following a novel therapy.

同所膵臓癌マウスモデルのダイナミックコントラスト強化磁気共鳴画像

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

肝細胞癌転移の「患者様」同所同系マウスモデル

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...