壊死、アポトーシス、血小板活性化の特徴を示す凝固促進血小板の包括的解析

私たちの研究は、抗リン脂質抗体症候群や癌などの前血栓状態における血小板代謝とシグナル伝達の理解に焦点を当て、新しいバイオマーカーと治療標的を特定することを目的としています。私たちのグループは、血小板代謝が血小板の活性化と血栓症にどのように寄与するかについての最近の関心の高まりの先頭に立っています。血栓症のリスクと抗血小板薬の治療効果を判断するために、患者の循環中の血小板活性化状態を正確に評価することは、依然として大きな課題です。

好気性解糖、ペントースリン酸経路、および脂肪酸のベータ酸化は、血小板の特徴的なエネルギー代謝経路として解明され、その可能性が治療標的として確立されました。このプロトコルは、凝集促進性血小板とは異なる凝固促進血小板、およびアポトーシスまたは壊死による細胞死を受けている血小板の同定と正確な機能特性評価を支援するのに役立ちます。まず、100マイクロリットルの血小板懸濁液に0.5マイクロリットルの0.5モルストック塩化カルシウム溶液を添加することにより、洗浄したヒト血小板に2.5ミリモルのカルシウムを補給します。

血小板の1つの画分を刺激しないようにし、トロンビンとけいれん薬の組み合わせで残りの画分を室温で15分間刺激します。.刺激後、アネキシンV、パック1、抗CD62P抗体をそれぞれ1マイクロリットル、刺激した血小板懸濁液100マイクロリットルに加えます。血小板を暗所で室温で30分間インキュベートします。

30分後、等量の2%ホルマリンを加えて血小板を固定してから、フローサイトメトリーでサンプルを分析して凝固促進血小板を定量します。血小板の調製には、洗浄したヒト血小板を1ミリリットルあたり100万血小板の濃度に希釈し、2.5ミリモルのカルシウムを補給します。ミトコンドリアカルシウム検出のために5マイクロモルのROD2で血小板を標識し、暗所で30分間インキュベートします。

カスパーゼ活性化アッセイ用の血小板の調製では、血小板にカルシウムを補給し、画分を刺激した後、刺激した血小板懸濁液に活性カスパーゼ標識ダイを添加します。血小板を暗闇で30分間インキュベートします。30分後、フローサイトメトリーで血小板を分析する前に、等量の2%ホルマリンを添加して血小板を固定します。

結果は、トロンビンがホスファチジルセリンとP-セレクチンの両方を発現する血小板の割合の用量依存的な増加を誘発したことを示しています。トロンビン刺激はまた、血小板中のミトコンドリアカルシウムレベルの時間依存的な増加を引き起こしました。しかし、トロンビン刺激は血小板のミトコンドリア膜電位の低下をもたらしました。

トロンビン刺激は血小板中のカスパーゼ-8を活性化したが、カスパーゼ-3または7は活性化しなかった。