ありがとう献血者及び人材カナダの血サービス ネットワーク センターで適用開発コレクションや本研究で使用される血小板単位の生産のため。我々 は血の研究のための UBC のセンターでインフラ資金の健康研究イノベーションとマイケル ・ スミス財団のカナダの財団を認めます。出版物のための資金は、LightIntegra テクノロジー株式会社、ThromboLUX の製造元によって提供されました。

次のプロトコルは、すべてのカナダの血サービス (CBS) のガイドラインに準拠して行われています。ボランティアが彼らの寄付ができることに同意を与えたこれらの研究を遂行するために使用します。血小板製剤は、CBS 標準業務手順書に従って調製しました。ここで説明したすべてのパフォーマンス テストを行ったセンターで血液研究ブリティッシュ ・ コロンビアの大学、バンクーバー、カナダの機関研究倫理委員会の承認と。
1. 品質管理チェック
<ol><li>少なくとも一度 DL システムの適切なオペレーションを確認する日をテストごとの品質管理チェックを実行します。使用するメーカーの指示に従って指定されたコントロール ビーズ (50 nm の半径) を測定します。</li>
	<li>コールド ストレージからコントロール バイアルを取得し、常温に 15 分を許可します。ビーズは、使用する前に室温に釣り合う必要があります。</li>
	<li>最初のサンプルはテストの準備時間 15 分レーザー ウォーム アップ期間を完了するようにサンプルを準備する前に DL システムをオンにします。</li>
	<li>コンソールを立ち上げた、一度ログインしてシステムのテストを選択して、コントロールのサンプルを測定するタッチ スクリーンの指示に従います。</li>
	<li>渦ミックス 10 バイアル s 代表的なサンプルを確認します。</li>
	<li>100 μ L の一定量ピペット、ピペット チップおよびテスト キットからキャピラリーを用いた制御ビーズで毛細血管を埋めます。</li>
	<li>テストが完了すると DL システムの画面の指示に従います。 注: コントロール ドロービード試験結果が自動的にコントロール ビーズ バーコード ラベルとパスに格納されている情報と比較やサンプル情報と同様に、失敗通知をテストの終わりに DL システム画面に表示。</li>
</ol>2. 血小板の濃縮物からサンプルを取得
注: これらの手順は、テスト ルーチン血小板在庫管理用キャピラリー DLS に血小板輸血から非侵襲的サンプリングのプロセスを説明します。概要を図 1に示します。必要な付属品: チューブ シーラー、手動管ストリッパ、はさみ、スプラッシュシールド。
<ol><li>未検証の在庫から血小板の濃縮物を削除します。</li>
	<li>未使用サンプリング ポーチから血小板の製品のサンプルを入手 (2.3 の手順に進みます) またはチューブ セグメント (空の場合 2.4 の段階に進むまたは手順 2.5 空でない場合)。 袋を切断するには、配管またはチューブ セグメントはチューブ シーラーを使用します。チューブ シーラーを操作するには、製造元の指示を従ってください。簡単に言えば、2 つ温水顎間の正確な位置にシールするチューブをクランプします。ハンドヘルド デバイスで一緒に溶融チューブを押して、高圧力の下で (期間中は緑色の光で示される) レバーを押しながらクールな永久的な漏れ防止シールの結果します。</li>
	<li>
ポーチからサンプリング
	<ol>
<li>5 穏やかな水平運動によってよく血小板バッグの内容をミックス s (チップ端から端まで 5 回)。</li>
		<li>ポーチにクランプを開きます。ポーチや避難はそれ自体でいっぱいになります。のみ 100 μ L のサンプルが DL テストに必要な場合袋を完全に記入する必要はありません。</li>
		<li>ヒートシール接続チューブ チューブ シーラーで袋から袋を外します。手順 3 に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
空チューブからサンプリング
	<ol>
<li>血小板がバッグを確認チューブを空に格納されているし、チューブ ブロックが設定されています。チューブ チューブで血小板の濃縮物のかなりの量がないことを確認を調べます。チューブが空でない場合は、2.5 の手順に進みます。</li>
		<li>ローラー間チューブを圧迫するハンドルを圧縮することによってできるだけチューブ ブロックに近いとして管の上管ストリッパを閉じます。</li>
		<li>垂直に袋を掛けるし、ストリッパーのハンドルを圧縮してください。</li>
		<li>ストリッパーを維持するを閉じると、配管ブロックをリリースします。</li>
		<li>ストリッパーの後ろに合わせてゆっくりとチューブを可能にする空の管をストリッパーをゆっくり引き出します。後述のストリッパーが完全に膨張するかストリッパーが管末の 1 インチまでを続行します。</li>
		<li>使用熱管シーラー シール チューブのストリッパーと停止位置に達すると、ストリッパーの上の 1 インチ。</li>
		<li>手動管ストリッパのハンドルを解放します。</li>
		<li>ヒートシールのもう一度テストのセグメントを作成する以前のシールの上の 1 から 2 インチ。</li>
		<li>血小板ユニットからテストのセグメントを切断します。このセグメントは、dl がテストされます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
空ではないチューブからサンプリング
	<ol>
<li>垂直に袋を掛けるし、場所の場合チューブ ブロックをリリースします。</li>
		<li>任意の大きな固体の塊があるかを決定するためのチューブを目視で確認します。彼らは袋に脱げないように固体の塊が存在する場合はそれらの上シールします。</li>
		<li>できるだけチューブのシールの端として管の上管ストリッパを閉じます。</li>
		<li>袋に向かってチューブに沿って管ストリッパを移動クランプ力を維持しながら、ローラー間、チューブを圧迫するハンドルを圧縮して袋にチューブの内容を除去します。</li>
		<li>吊りフックから血小板のバッグを取り出して、軽くミックス 5 袋をひっくり返すことによってそれ端から端まで 5 回ストリッパーを維持しながら s を閉じる。</li>
		<li>閉じたストリッパーを維持しながら垂直方向に袋を掛けます。</li>
		<li>ストリッパーの後ろに合わせてゆっくりとチューブを可能にする空の管では、ダウンのストリッパーをゆっくり引き出します。後述のストリッパーが完全に膨張するかストリッパーが管末の 1 インチまでを続行します。</li>
		<li>使用熱管シーラー シール チューブのストリッパーと停止位置に達すると、ストリッパーの上の 1 インチ。</li>
		<li>ストリッパーをリリースします。</li>
		<li>ヒートシールのもう一度テストのセグメントを作成する以前のシールの上の 1 から 2 インチ。</li>
		<li>切断し、管の最後の部分を破棄します。</li>
		<li>血小板ユニットからテストのセグメントを切断します。このセグメントは、dl がテストされます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 毛細血管をテスト DL にサンプルを充填
<ol><li>スプラッシュシールドと清潔で乾燥したはさみを使用してチューブまたはセグメントをテスト ポーチの一方の端をカットしました。 注: テスト DL 用キャピラリーはすぐに記入されるべき。</li>
	<li>(組み立てられた 100 μ L の一定量ピペット、ピペット チップ、キャピラリー) キャピラリーに開いたポーチまたはチューブ セグメントから直接サンプルを描画するためのサンプリング ツールを使用して、毛細血管を記入してください。</li>
	<li>優しく穏やかなひねりを加えた、トレイに対していくつかの圧力を適用するとき毛管シーリング材に充填キャピラリーを押すことにより充填キャピラリーの底をシールします。</li>
	<li>キャピラリー チューブのシール材にしっかりと埋め込まれて固定ボリューム ピペットおよび毛管、キャピラリーを保持からのヒント 100 μ L を外します。</li>
	<li>キャピラリー チューブのシール材トレイから毛細血管を削除、イソプロピル アルコール パッドで一掃し、毛細血管の下部を軽くフリックで閉じ込められている空気の泡がないことを確認します。</li>
	<li>DL システムにキャピラリーを配置します。</li>
</ol>4. DL テストを実行します。
<ol><li>血小板サンプルの微粒子の内容を測定するための新しい DL テストを開始する MP テスト オプションを選択します。</li>
	<li>サンプル情報 (寄付識別番号 (ISBT)、コレクション/生産期限や製品コード) を入力してバーコード スキャナーを使用して、または手動で。</li>
	<li>製品コードが見つからない場合、DL システム流体媒体情報を抽出、適切な流体媒質を手動で選択 (ほとんど血小板濃縮プラズマを選択、血小板添加剤ソリューション (PAS) を含むサンプルを入力、残留プラズマの割合)。 注: 公称 65% から PAS 割合に小さい偏差が計算される MP 半径がない MP を % にほとんど影響しません (DL システムで自動的に計算) 粘度で小さなエラーが発生します。</li>
	<li>指示に従って DL システムにキャピラリーを配置し、テストを開始します。</li>
	<li>テストが完了したら、キャピラリー ホルダーと施設のガイドラインに従って適切に消耗品の処分からサンプルを削除します。キャピラリー ホルダーと施設のガイドラインに従って適切に消耗品の処分からサンプルを削除します。</li>
	<li>タグ血小板バッグの結果、たとえばオレンジ色に対応する色で非アクティブ (均質) %mp 等しいまたは 15% とピンクの下で % MP 15% 以上 (異種) 活性化します。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig1.jpg"> 図 1: メソッドの概要。病院の血液銀行で定期血小板在庫管理に対して実行する手順の概要: 微粒子を識別するためにテスト DL を実行する DLS 測定用キャピラリーにサンプルを読み込む、濃縮血小板からサンプルを取得報告された微粒子の活性化した血小板を識別するためにコンテンツを使用します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

EMS は、LightIntegra テクノロジー株式会社、微粒子や血小板品質テストに ThromboLUX システムを開発し医療機器会社の創設者です。他のすべての作成者は、LightIntegra 技術の従業員です。生産とこの記事への無料アクセス、LightIntegra テクノロジー株式会社主催します。

このプロトコルでは、血小板の濃縮など生物学的サンプルで見つかった高粒子濃度の最適化された微粒子検診動的光散乱法について説明します。DL の方法は本質的にサイズを正確に測定する標準化されました。血小板濃度が知られていて、参照ピーク19として血小板ピーク面積を使用場合、微粒子の相対濃度は絶対濃度に変換できます。血小板として濃度は、通常の血球計数装置が得られるまたは流れの cytometers これらの方法を考えることが DL にコンパニオン技術。
DL のシステムの機能は、コントロールのビーズを定期的に実行して、被保険者です。蒸留水は、バック グラウンド ノイズが最小限であることを確認する測定できます。MP ネガティブ コントロールとして、MP 陽性コントロールとして 125 nm 半径ビーズの添加後、市販の血小板基準を分析できます。興味の生物的範囲の MP 濃度内で手順は、実用的かつ迅速に血液銀行のルーチンの一部として実行します。
フローサイトメトリーではなくこのメソッドに基づいていない粒子の散乱強度がむしろ彼らのブラウン運動の速度を比較します。したがって、エクソソームはサイズが小さいにもかかわらずも検出することができます、MP から別に報告されます。
スクリーニング ツールとして設計され、このメソッドの制限事項は、微粒子の種類を区別できないことに関連しています。追加の分離手順を使用する場合、潜在的な改善の余地があります。サンプルは前に、と後、抗体の微粒子による特定の駆除結合磁性体ビーズ キャプチャ テストでした。さらに、検出されたすべての微粒子が細胞に由来高脂血症47,48と小さな細菌またはウイルス6形成、チロミクロンまた微粒子の範囲で報告されるのでそれを想定できません。ただし、その他の措置は、lipemic や病院の血液銀行の在庫を入力する汚染された血小板を避ける高度への血液供給内に存在します。
血小板の活性化、したがって MP コンテンツ49の範囲をサンプルで抗凝固剤の選択に影響します。さまざまな製品の比較この要因を考慮する必要があります。MP コンテンツと不均一性を決定するしきい値の PAS など MP 無料サスペンション メディアでプラズマの交換の影響また、-場合にのみ集中することに残留プラズマ内 MP は、元のコンテンツの約 3 分の 1 を左、それに応じてコンテンツ下限 MP 100% プラズマのように血小板の活性化の同じレベルがわかります。パーセントの MP は、血小板に対する MP コンテンツです。以前、平均 %mp はまだ 9.519PAS 製品の平均血小板数が低かったことが報告されました。米国でライセンスされた PAS 血小板 %mp のしきい値は 10% に設定されています。
血小板にストレスを引き起こすプロセスがストレスに血小板の感受性に応じて MP レベルを上げる、血小板製剤で MP の主なソースは、ドナーが、-場合は血小板をアクティブすでに非常にマイナー ストレスなど病原体不活化、洗浄、貯蔵寿命を拡張照射や長距離輸送は、MP は、コンテンツの大幅な増加につながる可能性があります。これらのストレスのどれもが均質、非活性化血小板19に大きく影響する示されています。また、注意する必要があるキャピラリー内サンプル組成の変化の可能性に支払われるテストされていない場合準備 (このプロトコルの手順 3 の完了) 後すぐに。
このプロトコルの焦点は、血小板輸血、血小板活性化のバイオ マーカーとしての微粒子を使用する粒子の組成を決定するのです。血小板輸血のいずれか非活性化 (オレンジ) タグまたはアクティブ化 (ピンク) 15% の微粒子の割合のしきい値に基づいて。100% プラズマにおける血小板の MP は、経験的に決め複数サイトから平均 66th百分位数として 15% のしきい値です。
DLS によるルーチンの微粒子に基づく血小板在庫管理の目的は、非免疫血小板不応性を防ぐことによって患者のケアとドライブのコスト効率を改善するためにです。血小板袋のスクリーニングのための DL システムの実装は、血小板不応性を開発するためのリスクで最も患者に非活性化血小板を指示するユーザーを有効にします。

微粒子への関心はほとんど細胞細胞コミュニケーションと生物学的プロセスに関与中心でした。1,2,3最近、微粒子がまた関心を集めて自己免疫疾患および心血管疾患の早期診断マーカーとして。4,5として知られている細胞の小胞または、エクソソームの微粒子は、広くフローサイトメトリーによって研究されてきた。残念ながら、従来の流れの cytometry のプロトコルを標準化するための努力にもかかわらず無いコンセンサスを使用する最適なプロトコル。6,7,8,9,10
従来のフローサイトメトリーは、特定の MP のサブポピュレーションを特徴付けることができる、制限報告11が収められています。11,12,13,14これらの制限のいくつかは、いわゆる高出力レーザーや検出器を使用して対処されている「小さな粒子オプション」、15、16 15 °-25 ° 前方で検出角度を散布し、シース圧を変更.17,18それにもかかわらず、これらの高度な方法と組み合わせることができます迅速かつ簡単に使用できるスクリーニング法まだ必要です早期診断マーカーとしての微粒子を利用します。微粒子レベルの上昇は正常な血液ドナー19の約 3 分の 1 で検出可能であり、潜在性の条件を示す可能性があります。その結果、献血血液製品に高い微粒子レベル影響を受ける受信者と互換性があるかもしれない。20
血小板輸血に際し、非免疫不応性 - 前記患者の体連続輸血を拒否し、循環する血小板のかなりの部分を許可しない状態の危険性があります。21,22非免疫不応性無駄な輸血の結果、健康合併症患者、および延長病院の滞在します。23微粒子の高番号を含む血小板輸血は影響を受ける血液がん患者における非免疫不応性の開発のための貢献の要因をすることができます。20微粒子傷つきやすい患者のリスクを減らすためのスクリーニングによって血小板輸血の組成によると血小板の在庫を管理することが可能です。ただし、ほとんどの微粒子検査血小板5,12から微粒子を分離する必要または非常に労働は、それ以外の場合集中24,25したがってない実装できます定期的に病院で血液銀行。
説明する手法は、ここで動的光散乱 (DL) - としてまた知られている光子相関分光法や準弾性光散乱を使用します。何十年も、動的光散乱広く使用されています製薬業界におけるリポソーム医薬品製剤またはエマルジョンの特性評価に粒径がサブミクロン範囲内にあります。26,27しかし、これらのアプリケーション開発ツールは、画面血液製剤に最適化されていません。新しい DL システムは、技術的な限界を克服し、血小板輸血のスクリーニングに役立つ動的光散乱に開発されました。28
動的光散乱測定は、懸濁粒子レーザー光を照らすと、粒子懸濁液中の移動の結果である散乱光強度の時間変化の分析によって実行されます。さらに、高速小さな粒子が移動されたときにこのメソッドを使用して、パーティクルの速度およびサイズの間の逆関係、大きな粒子はサイズ分布とサンプル コンポーネントの相対的な濃度情報を提供するためにゆっくりと - 移動します。平均微粒子の DL を使用して微粒子コンポーネントのコンテンツ、平均半径を定量化することができます。血液製剤の微粒子のコンテンツは、% MP 50 550 nm から粒子半径測定ヒストグラムのエリアをベースとして与えられます。50 以下の半径で粒子をしながら nm は DLS により検出および %mp には含まれていない DL システムによって報告されます。血小板から微粒子を分離するのではなく血小板輸血の不均一性は、微粒子とサンプルの血小板の相対的な内容に基づいて決定されます。実際には、血小板と微粒子のピーク比は、血小板数がわかっている場合は、絶対 MP 濃度を計算する使用できます。19
DL システムは、人間の血液や血液製剤由来の標本は、微粒子に関する定性的および定量的な情報を医療従事者を提供します。Cytometry 流れ、電子顕微鏡、分析30または31を検出可変抵抗パルス追跡29ナノ粒子などの代替技術の説明の DL 方法の主な利点は、サンプル準備です。血小板製剤の因数は、血小板、サンプル希釈またはその他の変更から MP を分離することがなく直接測定できます。9,17また、DL に絶対サイズ変更メソッドは、適切な屈折率の校正ビーズの欠如に苦しむされず。14,32
血小板活性化と MP は、コンテンツの相関顕微鏡33,20によって示されている以前と病理学の条件15,34,の MP 量の増加から推測することができます。35,36血小板をアクティブにする知られている培養条件の下で。19,37,38しかし、さらに研究が必要完全に微粒子の DLS 測定コンテンツと血小板活性化との関係を理解します。当社の現在の知識に基づいて積極的に出血患者39、非活性化恩恵を受ける血液がん患者の治療に使用される活性化した血小板が、最高な微粒子、高数が含まれてない血小板または微粒子20の低レベル。最近、回復と安定、大抵非出血血液腫瘍患者40 に単一輸血におけるこれらの血小板の生存ドナー血小板の生体外での応答性が大幅に影響しなかったと報告されています。.この発見からまた高 MP の内容によって識別される血小板活性化は患者の予防的治療でない重要な役割を担うが締結される可能性があります。ただし、患者の絞込みのため本研究はないの複雑な患者は発熱 (研究から除外) ドナーの要因の影響に対応し、安定していない多くの 2 つ以上の血小板輸血を受け取る。-これは不応期を短縮するための約束を保持している - どのようにこれらの患者の場合のコストを削減できる質問は未解答に残る。
微粒子炎症41,42,43,44 , 血小板活性化45の早期マーカー、したがって多く通常ドナーで検出されます。19は、したがってに活性化した血小板および微粒子は、血小板の寄付金で表示されます。熱、すなわち、完全に活性化生得免疫システム、患者が活性化した血小板の輸血の追加の課題を許容できないと仮定するが妥当です。しかし、研究はこの仮説を証明するために必要です。微粒子スクリーニングは血小板輸血の内容について現在の不確実性を軽減し、患者の治療の複雑さを軽減できます。
病院の血液銀行の非活性化に活性化した血小板の割合依存ドナー人口に主に、輸送や照射、病原体不活化血小板活性化を増やす可能性があります他のプロセスにはるかに低い程度に集中しています。19アメリカ合衆国の主要な病院血液銀行からデータを示した血小板在庫の平均組成がアクティブ化される 49%、51% が非活性化 (活性化した血小板の範囲: 38 62%、個人通信)。血液製品プロバイダーや病院の血液銀行は彼らを生成または受信、および彼らの目録を管理するどのように多くの活性化および非活性化血小板製剤として微粒子によって示される血小板活性化に基づくを知りたい場合コンテンツ、これプロトコルはそれらのために適切かもしれない。
病院の血液銀行は予防のための非活性化、同質な血小板を使用し、活性化、異機種混在の血小板治療上の使用を直接できる血小板成分に基づきます。血小板スクリーニングでは、病院への患者のケアを向上し、コストを削減在庫の使用率を最大化することができます。このプロトコルは、基本的な処理および血液製剤の操作に精通している研究者向けです。
ここに提示すると、微粒子の内容に基づいて製品を選択することが望ましい、微粒子病院血液銀行在庫管理に定期的に適用できる血小板輸血のスクリーニング法です。この議定書の目的は、寄付された血小板のスクリーニングのための実装と DL の評価の概要を説明することです。記述されていたプロトコル アドレス サンプルは、非侵襲的なアクセス、血液銀行の仕事の流れと性能テストの統合の一般的な質問です。

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >ThromboLUX-M</td>
			<td >LightIntegra Technology Inc.&#160;</td>
			<td >LPN120</td>
			<td >DLS System</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ThromboSight Software</td>
			<td >LightIntegra Technology Inc.&#160;</td>
			<td >LPN124</td>
			<td >DLS analysis software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Capillaries</td>
			<td >LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Optinova MLE)</td>
			<td >LPN065</td>
			<td >Custom extruded non-activating, non-birefringent plastic tube, inspected and irradiated</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MiniPet&#160;</td>
			<td >LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor TriContinent Scientific)</td>
			<td >LPN082</td>
			<td >100 &#181;L fixed volume pipette for sampling&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MicroFlex 1-200 &#181;L Pipette tips</td>
			<td >LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor ESBE Scientific)</td>
			<td >LPN080</td>
			<td >Pipette tips for sampling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Critoseal&#160;</td>
			<td >LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Fisher Scientific)</td>
			<td >LPN075</td>
			<td >Capillary Tube Sealant</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dukal Alcohol Pad or equivalent</td>
			<td >LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Dukal Corp.)</td>
			<td >LPN085</td>
			<td >Isopropyl pad (saturated with 70% isopropyl alcohol)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Control beads, 50 nm radius</td>
			<td >LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor PolySciences Inc.)</td>
			<td >LPN128</td>
			<td >Control beads</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microbead NIST Traceable Particle Size Standard, 3 &#181;m</td>
			<td >PolySciences Inc.</td>
			<td >64060</td>
			<td >Standard microbeads: 1.5 &#181;m radius Polystyrene beads; range 1.43-1.58 &#181;m; 1% solids suspensions in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nm</td>
			<td >PolySciences Inc.</td>
			<td >64014-15</td>
			<td >Standard nanobeads: 125 nm radius Polystyrene beads; range 120 - 130 nm; 1% solids suspensions in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Genesis BPS RapidSeal II or equivalent</td>
			<td >Genesis BPS</td>
			<td >428-SE640</td>
			<td >Tube sealer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fresenius Kabi Tube Stripper or equivalent</td>
			<td >Fresenius Kabi</td>
			<td >6R4452</td>
			<td >Manual tube stripper</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biohazard Shield - Cell Counter or equivalent</td>
			<td >CardinalHealth</td>
			<td >S1389-75</td>
			<td >Splash Shield</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning LSE Vortex Mixer or equivalent</td>
			<td >Corning Incorporated</td>
			<td >6775</td>
			<td >Vortex mixer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FACSCanto II Flow cytometer&#160; with FACSDiva software version 6.1.3 or equivalent</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >338960</td>
			<td >Flow cytometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

routine screening method for microparticles in platelet transfusions

微粒子含有濃厚血小板をスクリーニングに基づく血小板在庫管理は病院の血液銀行の新しい品質改善の取り組みです。彼らが強調しているとき、セルは微粒子 (MP) をフラグメントします。血と血のコンポーネントから様々 な細胞、活性化した血小板から最も顕著な細胞断片があります。自然免疫系細胞や主要なプレーヤーとしての役割を実行する、凝固と止血で、血小板は形を変え、微粒子を生成します。動的光散乱法 (DL) と-基づく微粒子検出非活性化 (低微粒子) 血小板輸血、内から活性化 (高微粒子) を区別するため、この不足している血液製剤の使用を最適化することが可能です。これまでの研究では、非活性化血小板の血液腫瘍患者における予防的使用のために提供することが難治性になることのリスクを軽減、患者ケア向上を示唆しています。このスクリーニング法の目的は、非活性化血小板からアクティブに日常的に区別するためにです。病院の血液銀行で定期血小板在庫管理に対して実行する手順の概要をここで述べる方法: テスト DL を実行するサンプルを読み込んで DLS 測定用キャピラリー血小板輸血からのサンプルの取得微粒子、および活性化した血小板を識別するために報告された微粒子のコンテンツを使用して識別します。

平均準備時間 DL システムを使用してプロセスをスクリーニング血小板は、図 1のとおりです。血小板は、血液供給業者からの領収書の時間で DL システムがテストされます。表 1に詳細な訓練されたユーザーの平均準備時間は 2 分 23 秒でクリーンアップと事後テスト作業時間は 14 秒と 46 秒、それぞれ。合計では、平均的なユーザーは 3 分と 23 テストごとのハンズオン タイムの s。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>アクティビティ</td>
			<td>アクティブな時間</td>
			<td>徒歩距離のテスト時間</td>
			<td>合計</td>
		</tr>
<tr>
<td>DL のシステムを準備します。</td>
			<td>14 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>サンプリング ツールを組み立てる</td>
			<td>28 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>セグメントを取得します。</td>
			<td>52 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>毛細血管を入力し、テストを開始</td>
			<td>49 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>5 分</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>クリーンアップ</td>
			<td>14 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>タグと在庫の血小板バッグ</td>
			<td>46 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>サンプルごとに必要な合計時間</td>
			<td>3 分 23 秒</td>
			<td>5 分</td>
			<td>8 分 23 秒</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: アクティブなテスト時間内訳。テスト自体は、5 分の平均時間と歩行距離テストです。平均的なユーザーは、テストの DL システムを準備、取得してこのプロトコルを次のサンプルをテストし血小板バッグのタグ 3 分 23 秒をかかります。
精度 DL のシステムの精度は 0 7 3 つの微粒子レベルで評価された %、12-25%、28-75%。%Mp の臨床的に関連する範囲は 3 75% です。2 つの演算子は、並列で 2 つの DL システム 16 営業日の低、中、および高のコントロールのサンプルをテストしました。サンプルは、各試験日の重複がランダムな順序でテストされました。
表 2は、血小板に対する % 微粒子 (%mp) の DLS 測定のデバイス内で精度をまとめたものです。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">微粒子コンテンツ</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>低</td>
			<td>媒体</td>
			<td>高</td>
		</tr>
<tr>
<td>意味 %mp (%)</td>
			<td>4.4</td>
			<td>19.5</td>
			<td>53.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>標準偏差 (%)</td>
			<td>1.8</td>
			<td>2.6</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CV (%)</td>
			<td>40.4</td>
			<td>13.2</td>
			<td>10.6</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: % 微粒子 (%mp) のデバイス内の精度です。小さな血小板 % に貢献するかもしれない非常に低い微粒子コンテンツで MP は低微粒子コンテンツ サンプルの変動を増加しました。
50 550 nm 間の平均微粒子半径の DLS 測定のデバイス内で精度を表 3に示します。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">微粒子コンテンツ</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>低</td>
			<td>媒体</td>
			<td>高</td>
		</tr>
<tr>
<td>半径 (nm) を意味します。</td>
			<td>331</td>
			<td>161</td>
			<td>188</td>
		</tr>
<tr>
<td>標準偏差 (mm)</td>
			<td>133</td>
			<td>41</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>CV (%)</td>
			<td>40.1</td>
			<td>25.2</td>
			<td>13.5</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 3: 微粒子の半径の内でデバイスの精度です。非常に低い微粒子でコンテンツの小さな血小板 % 微粒子 (%mp) に貢献するかもしれない低微粒子コンテンツ サンプルのばらつきの増加の結果します。
表 4は、DLS % 微粒子 (%mp) 測定の再現性を示します。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">微粒子コンテンツ</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>低</td>
			<td>媒体</td>
			<td>高</td>
		</tr>
<tr>
<td>意味 %mp (%)</td>
			<td>4.4</td>
			<td>29.2</td>
			<td>53.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>再現性 (%)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2.3</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CV (%)</td>
			<td>35</td>
			<td>11.8</td>
			<td>9.4</td>
		</tr>
</tbody></table>表 4: % 微粒子 (%mp) の動的光散乱 (DL) 測定の再現性。
直線性 DLS 結果は線形図 2ショー、すなわちサンプルの割り当てられた値に関して直線に合います。7 異なる微粒子コンテンツを用意しました。高 (MP7) と低 (MP1) 微粒子のコンテンツと一致する血小板濃度サンプル準備、中間サンプル (MPx) を作成する別の比率で混合します。サンプル フローサイトメトリー19および DL を前述のようにテストされ、各濃度 %mp 結果をプロットした入力と出力として。決定係数は 0.985 をことが判明しました。低、高微粒子コンテンツの DL のヒストグラムの例を図 3Aに。DL の結果は、フローサイトメトリー (図 3B) によって確認されました。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig2.jpg"> 図 2: フローサイトメトリーと DL 結果の比較します。%Mp の線形関係は、オープンの記号 ○ でマークされた 2 つのサンプルから元の DL データは図 3に示すフローサイトメトリー (入力) と DLS (出力) によって決まります。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig3.jpg"> 図 3: 微粒子コンテンツ活性化および非活性化血小板を区別します。(A) MP は、活性化した血小板 (破線) でコンテンツの DL 結果非活性化血小板 (実線) で 4% と比較して 57% であった。37 ° C の測定温度で試験を行った 1.06 の血漿粘度設定 x10-3 Pa·s、および 200 600 kHz の間の合計強度の設定。(B) (A) に示すように同じサンプルのフローサイトメトリー結果 (19を前述のように取得) の流れ前方散乱のヒストグラムで P1 と P2 を表す MP と血小板のゲート;活性化した血小板のイベント (左) の 76% は非活性化血小板 (右) のための 6% と比べて MP ゲートに落ちた。回帰直線では、一貫して高い結果につながるフローサイトメトリーによる %mp にバック グラウンド ノイズの定数の相対的寄与を示唆しています。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
特異性/干渉 標準化機構 (ISO) の国際組織は、検出または他の量、サンプルで現在がある中、ここだけを測定する測定プロシージャの能力として解析的特異性を定義します。微粒子スクリーニングの解析的特異性は、赤い血球 (RBC) によって影響される可能性があります。DLS では、MP は血小板のコンテンツを基準にして、コンテンツを測定します。RBC は、MP の相対的寄与を減らす血小板の散乱の寄与で RBC の散乱の寄与が含まれるためにを妨げる可能性があります。血液製剤の許容 RBC コンテンツの規制が存在します。8.0 で血小板の結果の 1 つのユニットで RBC を満載の血小板濃縮 2 mL で RBC 恕の AABB によって推奨されるしきい値の保守的な変換 x1010セル/L (前提: 赤血球量が 8.5 x10-14L、パックされた赤血球のヘマトクリット値が 68%、血小板ユニットの体積は 200 mL)。さまざまな製品で報告された残留赤血球濃度がこのしきい値の46を下回るです。
3 つの異なるドナーは、3 つの独立実験の対象として、2 つの別の日に血小板と赤血球 (RBC) を寄贈しました。血小板製剤 (サンプル参照) で初期の RBC コンテンツは 0.05 - 0.15 x109セル/L 診断で決定されました。5 その他のサンプルは、スパイクで既知量の赤血球血小板の濃縮物; の因数にによって作成されました。これらのサンプルのターゲット赤血球レベルが 1.0、5.0、10、40、80 x109セル/l.
赤血球の干渉のしきい値は約 1.0 x1010セル/L (図 4)、赤色の血液細胞の存在が視覚的に明白である (図 5) にレベルと相関します。このレベルでは、上記は、ことで視覚的に赤のサンプルを含む赤血球ヘモグロビンの報告された微粒子のコンテンツが低すぎることがなくことを意味する %mp が過小評価されました。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig4.jpg"> 図 4: %Mp (DL) と赤血球濃度 (セル/L) の線形関係。0.1 の赤血球濃度の増加 x1091.0 x109、5.0 x1091.0 x1010、4.0 x1010、および 8.0 x1010セル/L (左から右へ) (○ 実験 1、● 実験 2、□ 実験 3 の独立した実験から3、線形回帰直線が表示されます各実験のため)。1.0 を超える x1010 RBC/L %mp の過小評価に 。RBC 含むサンプルの外観は、図 5に示すです。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56893/56893fig5.jpg"> 図 5: サンプルを含む赤血球の外観。血小板の赤みサンプル含む赤血球濃度 0.1 x1091.0 x109、5.0 x1091.0 x1010、4.0 x1010、および 8.0 x1010セル/L 左から右へ。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56893/56893fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
精度 精度は、1 回の測定結果とサンプルに割り当てられた正しい量値の差として定義されます。この測定誤差には、測定バイアスによる推定体系的なコンポーネントと標準偏差から推定されるランダムなコンポーネントが含まれています。したがって、計測結果の精度、真度及び精度の組み合わせです。
標準的なビーズは、DL テストの精度を決定する使用されました。精度は、3 75 %mp のアッセイの臨床的に関連する範囲内で 2 つの濃度で評価しました。参照ビーズ混合参照ビーズは、既知のサイズと濃度を持っているので、既知濃度の試料を準備する使用されました。その結果、目的の粒径と濃度のサンプルを取得する参照ビーズをミックスできます。
微粒子を表す 125 nm radius 標準ポリスチレン ビーズを用い、1.5 μ m の半径のビーズが血小板を表すために使用されました。約 20%、50% の MP のコンテンツのビーズ混合微粒子分析の精度を評価しました。参照ビーズ表 5に示すように、分析証明書に関する文書化された粒子半径測定粒子の半径の精度を比較しました。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">125 nm ビーズ</td>
			<td colspan="3">1.5 μ m ビーズ</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2"></td>
			<td>分析証明書</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>分析証明書</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>20% MP</td>
			<td>50% MP</td>
			<td></td>
			<td>20% MP</td>
			<td>50% MP</td>
		</tr>
<tr>
<td>半径を意味します。</td>
			<td>122.0</td>
			<td>事業は 1,138億</td>
			<td>124.4</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.6</td>
			<td>1.60</td>
		</tr>
<tr>
<td>標準偏差</td>
			<td>4.5</td>
			<td>2.83</td>
			<td>3.6</td>
			<td>0.035</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.07</td>
		</tr>
<tr>
<td>CV</td>
			<td>3.60%</td>
			<td>2.48%</td>
			<td>2.89%</td>
			<td>2.20%</td>
			<td>3.74%</td>
			<td>4.05%</td>
		</tr>
<tr>
<td>精度</td>
			<td></td>
			<td>6.70%</td>
			<td>2.00%</td>
			<td></td>
			<td>6.50 パーセント</td>
			<td>6.30%</td>
		</tr>
</tbody></table>表 5: 動的光散乱 (DL) 測定の精度です。Dl サイズ比較結果 125 nm の半径 1.5 μ m の半径とビーズの分析証明書に対して混合物。

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Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

濃厚血小板含有微粒子をスクリーニングに基づく血小板在庫管理は品質改善活動の新しい病院の血液銀行です。目標は、活性化された血小板の使用を最適化するために非活性化血小板から区別するためにです。血液腫瘍患者に非活性化血小板を提供する難治性になる高リスクを減らす可能性があります。

血小板輸血で微粒子のスクリーニング法のルーチン

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.8K ビュー.  LightIntegra Technology Inc.. 濃厚血小板含有微粒子をスクリーニングに基づく血小板在庫管理は品質改善活動の新しい病院の血液銀行です。目標は、活性化された血小板の使用を最適化するために非活性化血小板から区別するためにです。血液腫瘍患者に非活性化血小板を提供する難治性になる高リスクを減らす可能性があります。

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High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be addressed as a matter of great urgency1-4. Multiple complementary 'omics' approaches have provided clues as to the genetic risk factors and pathogenic mechanisms underlying numerous neurodegenerative diseases, but most findings still require functional validation5. For example, a recent genome wide association study for Parkinson's Disease (PD), identified many new loci as risk factors for the disease, but the underlying causative variant(s) or pathogenic mechanism is not known6, 7. As each associated region can contain several genes, the functional evaluation of each of the genes on phenotypes associated with the disease, using traditional cell biology techniques would take too long. 
	There is also a need to understand the molecular networks that link genetic mutations to the phenotypes they cause. It is expected that disease phenotypes are the result of multiple interactions that have been disrupted. Reconstruction of these networks using traditional molecular methods would be time consuming. Moreover, network predictions from independent studies of individual components, the reductionism approach, will probably underestimate the network complexity8. This underestimation could, in part, explain the low success rate of drug approval due to undesirable or toxic side effects. Gaining a network perspective of disease related pathways using HT/HC cellular screening approaches, and identifying key nodes within these pathways, could lead to the identification of targets that are more suited for therapeutic intervention.
	High-throughput screening (HTS) is an ideal methodology to address these issues9-12. but traditional methods were one dimensional whole-well cell assays, that used simplistic readouts for complex biological processes. They were unable to simultaneously quantify the many phenotypes observed in neurodegenerative diseases such as axonal transport deficits or alterations in morphology properties13, 14. This approach could not be used to investigate the dynamic nature of cellular processes or pathogenic events that occur in a subset of cells. To quantify such features one has to move to multi-dimensional phenotypes termed high-content screening (HCS)4, 15-17. HCS is the cell-based quantification of several processes simultaneously, which provides a more detailed representation of the cellular response to various perturbations compared to HTS. 
	HCS has many advantages over HTS18, 19, but conducting a high-throughput (HT)-high-content (HC) screen in neuronal models is problematic due to high cost, environmental variation and human error. In order to detect cellular responses on a 'phenomics' scale using HC imaging one has to reduce variation and error, while increasing sensitivity and reproducibility. 
	Herein we describe a method to accurately and reliably conduct shRNA screens using automated cell culturing20 and HC imaging in neuronal cellular models. We describe how we have used this methodology to identify modulators for one particular protein, DJ1, which when mutated causes autosomal recessive parkinsonism21. 
	Combining the versatility of HC imaging with HT methods, it is possible to accurately quantify a plethora of phenotypes. This could subsequently be utilized to advance our understanding of the genome, the pathways involved in disease pathogenesis as well as identify potential therapeutic targets.

We describe a methodology combining automated cell culturing with high-content imaging to visualize and quantify multiple cellular processes and structures, in a high-throughput manner. Such methods can aid in the further functional annotation of genomes as well as identify disease gene networks and potential drug targets.

神経変性疾患におけるハイコンテントスクリーニング

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

医学

Preparation and Pathogen Inactivation of Double Dose Buffy Coat Platelet Products using the INTERCEPT Blood System

Blood centers are faced with many challenges including maximizing production yield from the blood product donations they receive as well as ensuring the highest possible level of safety for transfusion patients, including protection from transfusion transmitted diseases. This must be accomplished in a fiscally responsible manner which minimizes operating expenses including consumables, equipment, waste, and personnel costs, among others.
Several methods are available to produce platelet concentrates for transfusion. One of the most common is the buffy coat method in which a single therapeutic platelet unit (&ge; 2.0 x1011 platelets per unit or per local regulations) is prepared by pooling the buffy coat layer from up to six whole blood donations. A procedure for producing "double dose" whole blood derived platelets has only recently been developed.
Presented here is a novel method for preparing double dose whole blood derived platelet concentrates from pools of 7 buffy coats and subsequently treating the double dose units with the INTERCEPT Blood System for pathogen inactivation. INTERCEPT was developed to inactivate viruses, bacteria, parasites, and contaminating donor white cells which may be present in donated blood. Pairing INTERCEPT with the double dose buffy coat method by utilizing the INTERCEPT Processing Set with Dual Storage Containers (the "DS set"), allows blood centers to treat each of their double dose units in a single pathogen inactivation processing set, thereby maximizing patient safety while minimizing costs. The double dose buffy coat method requires fewer buffy coats and reduces the use of consumables by up to 50% (e.g. pooling sets, filter sets, platelet additive solution, and sterile connection wafers) compared to preparation and treatment of single dose buffy coat platelet units. Other cost savings include less waste, less equipment maintenance, lower power requirements, reduced personnel time, and lower collection cost compared to the apheresis technique.

This article describes the process used by &#214;rebro University Hospital to produce double dose buffy coat platelet concentrates prepared from whole blood donations and treated with the INTERCEPT Blood System for pathogen inactivation. The in vitro quality of the final platelet units are evaluated over 7 days of storage.

準備とINTERCEPT血液系を使用してDouble線量バフィーコート血小板製剤の病原体不活化

Blood centers are faced with many challenges including maximizing production yield from the blood product donations they receive as well as ensuring the ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

ゼブラ土着腫瘍モデルを用いたメラノーマの修飾のためのスクリーニング

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

マウス肺挿管の簡単な方法

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or in buffer (washed platelets), by the use of one or a combination of agonists. The use of washed platelets separated from their plasma environment and in the absence of anticoagulants allows for studying intrinsic platelet properties. Among the large panel of agonists, arachidonic acid (AA), adenosine di-phosphate (ADP), thrombin and collagen are the most frequently used. The aggregation response is quantified by measuring the relative optical density (OD) over time of platelet suspension under continuous stirring. Platelets in homogeneous suspension limit the passage of light after the addition of an agonist, platelet shape change occurs producing a small transitory increase in OD. Following this initial activation step, platelet clots form gradually, allowing the passage of light through the suspension as a result of decreased OD. The aggregation process is ultimately expressed as a percentage, compared to the OD of platelet-poor plasma or buffer. Rigorous calibration is thus essential at the beginning of each experiment. As a general rule: calibration to 0% is set by measuring the OD of a non-stimulated platelet suspension while measuring the OD of the suspension medium containing no platelets represents a value of 100%. Platelet aggregation is generally visualized as a real-time aggregation curve. Turbidimetry is one of the most commonly used laboratory techniques for the investigation of platelet function and is considered as the historical gold standard and used for the development of new pharmaceutical agents aimed at inhibiting platelet aggregation. Here, we describe detailed protocols for 1) preparation of human washed platelets and 2) turbidimetric analysis of collagen-induced aggregation of human washed platelets pretreated with the food dye Brilliant Blue FCF that was recently identified as an inhibitor of Pannexin1 (Panx1) channels.

We describe a straightforward method for the isolation of washed platelets from human blood followed by agonist-induced platelet aggregation measurements by turbidimetry. As an example we apply this method for studying the aggregation response of human platelets to collagen after a pre-incubation with the Pannexin1 channel inhibitor Brilliant Blue FCF.

コラーゲン誘発凝集に対するPannexin1阻害剤の効果ブリリアントブルーFCF：比濁法は、人間に洗浄血小板を

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

加速度計を使用して日常生活に上肢のパフォーマンスを定量化する方法

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

新生児マウス蝸牛移植法<em&gt;インビトロ</em&gt;聴覚研究のスクリーニングツール

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have been limited compounds available so far to attenuate TLR signaling and there have been no clinically approved TLR inhibitors (except the anti-malarial drug hydroxychloroquine) in clinical use. In light of rapid advances in nanotechnology, manipulation of immune responsiveness using nano-devices may provide a new strategy to treat these diseases. Herein, we present a high throughput screening method for quickly identifying novel bioactive nanoparticles that inhibit TLR signaling in phagocytic immune cells. This screening platform is built on THP-1 cell-based reporter cells with colorimetric and luciferase assays. The reporter cells are engineered from the human THP-1 monocytic cell line by stable integration of two inducible reporter constructs. One expresses a secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) gene under the control of a promoter inducible by the transcription factors NF-&#954;B and AP-1, and the other expresses a secreted luciferase reporter gene under the control of promoters inducible by interferon regulatory factors (IRFs).Upon TLR stimulation, the reporter cells activate transcription factors and subsequently produce SEAP and/or luciferase, which can be detected using their corresponding substrate reagents. Using a library of peptide-gold nanoparticle (GNP) hybrids established in our previous studies as an example, we identified one peptide-GNP hybrid that could effectively inhibit the two arms of TLR4 signaling cascade triggered by its prototypical ligand, lipopolysaccharide (LPS). The findings were validated by standard biochemical techniques including immunoblotting. Further analysis established that this lead hybrid had a broad inhibitory spectrum, acting on multiple TLR pathways, including TLR2, 3, 4, and 5. This experimental approach allows a rapid assessment of whether a nanoparticle (or other therapeutic compounds) can modulate specific TLR signaling in phagocytic immune cells.

Toll-like receptor (TLR) signaling plays an important role in the pathophysiology of many human inflammatory diseases, and regulating TLR responses by bioactive nanoparticles is anticipated to be beneficial in many inflammatory conditions. THP-1 cell-based reporter cells provide a versatile and robust screening platform for identifying novel inhibitors of TLR signaling.

トール様受容体シグナル伝達の阻害剤に対する食作用性免疫細胞における生物活性ナノ粒子のスクリーニング

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

Handheld Metal Detector Screening for Metallic Foreign Body Ingestion in Children

Coins are the most common ingested metallic foreign bodies among children. The goal of this protocol is to assess the accuracy and feasibility of using a handheld metal detector to detect ingested metallic foreign bodies in children. We propose that by introducing handheld metal detector screening early in the triage process of children with high suspicion of metallic foreign body ingestion, the number of radiographs being ordered to localize the metallic foreign body can be reduced in this radio-sensitive population. The study protocol requires the screening of the participants for history of foreign body ingestion and exclusion of patients with respiratory distress or metallic implants. The patient changes to hospital gown and items that could contain metal like eyeglasses, earrings, pendants, and ornaments are removed. The patient is positioned in the center of the room away from other metallic interferences. The working status of the handheld metal detector is first confirmed by eliciting a positive audio-visual signal. Then the screening is done in an erect position with head in extension to expose the neck, from the level of the chin to the level of the hip joint, to cover the anatomical areas from neck to pelvis in a zig-zag manner both anteriorly and posteriorly. A positive audio-visual signal is carefully noted during the scanning for the presence of metallic foreign body. Relevant radiographs are ordered as per the area detected on the metal detector screening. The handheld metal detector was able to precisely identify all the coins among the ingested metallic foreign bodies in our study. The handheld metal detector could not consistently detect non-coin metallic foreign bodies. This protocol demonstrates the accuracy of handheld metal detector in the identification and localization of coins and coin like metallic foreign bodies.

Here, we present a protocol to use the handheld metal detector, to screen for the presence of ingested metallic foreign bodies in children who present to the pediatric emergency medicine department with a history of foreign body ingestion.

ハンドヘルド金属探知器検診小児における金属異物摂取

Coins are the most common ingested metallic foreign bodies among children. The goal of this protocol is to assess the accuracy and feasibility of using a ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent vasoactive agents, nitric oxide (NO), can also act as a powerful inhibitor of platelet aggregation. Direct NO detection in blood is very challenging due to its high reactivity with cell-free hemoglobin that limits NO half-life to the millisecond range. Currently, NO changes after interventions are only estimated based on measured changes of nitrite and nitrate (members of the nitrate-nitrite-NO metabolic pathway). However precise, these measurements are rather difficult to interpret vis a vis actual NO changes, due to the naturally high baseline nitrite and nitrate levels that are several orders of magnitude higher than expected changes of NO itself. Therefore, the development of direct and simple methods that would allow one to detect NO directly is long overdue. This protocol addresses a potential use of platelets as a highly sensitive NO sensor in blood. It describes initial platelet rich plasma (PRP) and washed platelet preparations and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as NO generators. Phosphorylation of VASP at serine 239 (P-VASPSer239) is used to detect the presence of NO. The fact that VASP protein is highly expressed in platelets and that it is rapidly phosphorylated when NO is present leads to a unique opportunity to use this pathway to directly detect NO presence in blood.

Here, we present a protocol to address the potential use of platelets as a highly sensitive nitric oxide sensor in blood. It describes initial platelet preparation and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as nitric oxide generators.

VASP のリン酸化を測定することによって血液中の一酸化窒素の血小板ベースの検出

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...