インビボ 酵母中の生物発光レポーターを用いた代謝移行期の転写活性のモニタリング

私たちの研究または主な研究は、微生物の多様性、系統ゲノミクス、および発酵の応用に焦点を当てており、酵母の多様性、適応、特に酵母生物学の産業応用に重点を置いています。具体的には、酵母の発酵効率、風味生産、ストレス耐性について研究しています。ですから、私たちの最新の進歩は、特にパタゴニアの酵母系統学に関連しています。

次に、これを使用してビール発酵用の新規ラガー酵母を生成しますが、低アルコールビール用の新規酵母も使用しています。全体として、私たちはさまざまなオミクス技術と実験的進化を使用して、この新規酵母を生物遺伝学的応用のために開発しています。現在、ゲノムシーケンシング、ロングリードゲノムシーケンシング、トランスクリプトミクスなど、さまざまな技術を使用しています。

そして、この情報を使用して、私たちが持っているさまざまな菌株の実験的進化を行い、CRISPR技術やさまざまな酵母形質転換技術を使用してゲノム変化の一部を検証しようとします。そこで、2つの大きな課題があります。一つは効率的なビール発酵で新しいラガー酵母を生み出すこと、もう一つは全く逆のことです。

私たちは、特にパタゴニアから、低アルコールビールを製造できる新しい品種を手に入れたいと考えています。私たちの研究室から得られた2つの主要な結果を強調したいと思います。そのうちの1つは、ラガー酵母の母であるSaccharomyces eubayanusのパタゴニアの起源を特定することです。

そして今、私たちはビール発酵のための数十の新しいラガーハイブリッドも生み出しました。この2つが、私たちの研究の大きな発見だと思います。まず、形質転換した酵母株パッチからサンプルを採取し、5%グルコースと200マイクロモルのハイグロマイシンを含む酵母ペプトン培地に接種します。

培養物を25°Cで24時間振とうせずにインキュベートします。新鮮な培地で1〜10希釈で培養液をリフレッシュしてから、さらに24時間インキュベートします。無糖酵母ペプトン培地で細胞を洗浄し、1〜10希釈で試験培地に接種します。

試験培地にルシフェリンを最終濃度3ミリモルまで補充し、プラスミドの安定性を維持するために200マイクロモルのハイグロマイシンを添加します。混合糖成長試験では、酵母ペプトン培地中のグルコースおよびマルトース濃度を増加させるグルコース-マルトースマトリックスを使用します。200マイクロリットルの培養物を96ウェルプレートの各ウェルに分注します。

次に、ルミノメータープレートリーダーを使用して、30分ごとに72時間、620ナノメートルのルミネセンスと光学密度を測定します。積分時間を 1 秒に設定し、減衰を無効にして、レポーターの継続的な活動と細胞密度のモニタリングを確保します。発酵サンプリングと発光モニタリングのために、まず麦芽抽出物を水に溶かして麦芽抽出培地を調製します。

200 RPMで24時間撹拌しながら、摂氏20度のYPD培地5ミリリットルで酵母株を培養前変換しました。前培養物を50ミリリットルの麦芽抽出培地に移し、次いで摂氏20度でインキュベートし、毎分200回転で攪拌しながらさらに24時間インキュベートする。培養物を室温で1分間21,380Gで遠心分離し、細胞を回収します。

次に、50ミリリットルの微量発酵のために、麦芽抽出培地の12度プレートに細胞を再懸濁します。発酵性能を向上させるために、1リットルあたり0.3ミリグラムの塩化亜鉛を培地に補給します。接種量を計算して、反復間で細胞密度が一定になるようにします。

調製した培地に、計算された量の接種材料を接種します。次に、培養物を摂氏20度に14日間振らずに置きます。毎日失われた二酸化炭素を記録することにより、発酵の進行状況を監視します。

二酸化炭素生産の指標として累積体重減少を測定するために、毎日血管の重量を量ります。発光モニタリングのために、各微量発酵から定期的に200マイクロリットルをサンプリングします。ルシフェリンを添加して、最終濃度を3ミリモルにします。

ルミノメータプレートリーダーを使用して、620ナノメートルのルミネセンスと光学密度を減衰せず、積分時間1秒で測定します。エピソームレポータープラスミドpRS426-PMAL32-LUC-HphMXは、PMAL32プロモータールシフェラーゼORFとhphMXカセットで成功裏に構築されました。異なるルシフェラーゼ活性は、異なるグルコース濃度およびマルトース濃度下で、3つの形質転換株間で観察された。

CBS12357TとCL467.1はグルコースなしで活性化を示しましたが、QC18は活性化のために1%以上のグルコース濃度を必要としました。マイクロ発酵条件下では、3つの形質転換株すべてが、異なる時期にピークを迎える強い発光を示しました。ルミネセンスは野生型株には存在しませんでした。