このプロトコルは、疾患に関連するヒト遺伝子の異変異体がタンパク質機能に影響を与えるかどうかを判断することを可能にする。これは、最先端のアルゴリズムでも計算を行うのは困難です。この技術により、脊椎動物モデル生物よりも高速かつコスト効率の高いインビボ系ショウジョウバエメラノガスターを用いて、ヒトタンパク質のミスセンス変異体を迅速に分析することができます。
特定の変異体がタンパク質機能に影響を与えることを実証することは、希少疾患の診断に直接寄与し、疾患メカニズム分析および潜在的治療法の出発点として機能する。このプロトコルは、希少疾患に関連する変異体を研究する際に特に有用であるが、自閉症や癌のようなより一般的な疾患に適用することができる。タンパク質機能を反映するハエの再現性のある型を特定するのは困難です。
この型は遺伝子によって異なる場合があり、微妙な場合があります。ショウジョウバエを用いたヒトタンパク質の変異体の機能研究は、救助実験または過剰発現試験に基づいて行うことができる。手順を開始する前に、対象となるヒト遺伝子とそのモデル生物オルソログに関する情報を収集します。
フライビジュアルシステムにおけるヒトタンパク質の参照および変異体を過剰発現させることにより変異型機能をテストするために、Gal4上流活性化配列またはUASシステムの制御下で目的のヒトcDNAの参照または変異体を発現するトランスジェニックハエを生成する。特定のフライ組織でヒトタンパク質を発現させる特定のGal4ラインを選択するには、Gal4ラインから3〜5人の処女女性を、単一バイアルまたは重複でUASヒトcDNAトランスジェニックラインのそれぞれから3〜5人の男性と交差させる。十字架を2〜3日ごとに移して、できるだけ多くの動物を単一の十字架から取り出し、解剖顕微鏡の下で閉じた動物を調べ、参照株と変異株の違いを特定します。
目に見える欠陥がある場合は、ハエを画像化して、その形式を文書化します。視覚系の機能的欠陥をテストするためにハエを生成するために、ロドプシン1 Gal4ラインからヒトcDNAトランス遺伝子を参照または変異体を有する男性に交差処女女性が、ハエレチナにおけるR1〜R6に関心のあるヒトタンパク質を発現させる。ハエが閉じ始めたら、前生を新鮮なバイアルに集め、バイアルを適切な実験温度に設定したインキュベーターに3日間戻して、視覚システムが成熟できるようにします。
インキュベーションの最後に、適切な麻酔法でハエを固定し、各フライの片側をガラス顕微鏡スライドにそっと接着します。電気レチノグラムリグを設置した後、1.2ミリメートルのガラスキャピラリーを針の引き手に入れ、毛細管を破って直径0.5ミリメートル未満の2つの鋭い中空のテーパー電極を得ます。気泡を避けるために注意して100ミリモル生理的な溶液で毛細血管を充填し、銀線電極の上にガラスの毛細血管をスライドさせます。
毛細血管を所定の位置にクランプし、ハエを常温で少なくとも10分間暗闇を完成させます。習慣の終わりに、ハエを含むスライドを記録装置に置き、参照および記録電極を持つマイクロマニピュレータを目的のフライの近くに移動します。電極の先端を見て、精通した目の胸をハエの胸郭に入れ、記録電極を眼の表面に置きます。
電解電図記録を成功させるためには、目に浸透せずに小さなディンプルを引き起こすように、記録電極に適切な量の圧力を加えるのに注意してください。電極を設置したら、1次光を3分間消して、ハエを暗い環境に再び順応させます。再順応期間の終わりに、同じ電極を使用して、1つの条件ごとに少なくとも15のハエから電気レジノグラムを記録する20秒間、1秒間にシャッターを開閉します。
リファレンスとバリアントハエからの記録が完了したら、リファレンス、バリアント、コントロールからのエレクトロレティノグラム記録を比較して、差を評価します。次に、電解図データの過渡、脱分極、過渡および再分極の変化を評価します。本代表的な実験では、ヒト参照TBX2が機能的にオルソエインフライ遺伝子を置き換えることができなかったため、過剰発現ベースの研究が行われ、救助ベースの戦略は不可能であった。
ヒトTBX2を目のないGal4を用いて発達中の眼および脳の一部で過剰発現した場合、過剰発現は約85%の致死性をもたらし、眼の大きさが有意に減少する。対照的に、変異遺伝子は致死性を引き起こすにあまり強力ではなく、同じ実験条件下で同じドライバーを使用して小さな眼表現型を誘導し、その変異体がタンパク質機能に影響を与えることを示唆している。さらに、ヒトTBX2がロドプシンGal4を用いて光受容体に過剰発現すると、過発現が電解線跡に重大な変化を引き起こす。
この表現型は、変異タンパク質が発現すると、インビボにおけるタンパク質機能に影響を及ぼすさらなる証拠を提供する。すべての遺伝子がユニークであるため、すべての疾患関連変異体の影響を評価できる単一の実験が存在することに注意することが重要です。ヒトcDNAの研究に加えて、オルソエナビエハエ遺伝子の進化的に保存された残基に類似バリアントを導入することによって、変異体が機能的な結果をもたらすかどうかを判断することもできます。
この方法を用いて、未診断疾患ネットワークや他のグループと共同で多くのヒト疾患遺伝子発見研究に貢献してきました。
