양성 조절자(positive regulator)를 사용하면 세포가 세포주기 확인지점을 통과할 수 있습니다. 음성 조절자(negative regulator)는 세포가 특정 기준을 충족할 때까지 세포주기 진행을 종료하거나 일시 정지시키 때문에 양성 조절자와 마찬가지로 중요한 역할을 합니다.

가장 잘 알려진 세 가지 음성 조절자에는 p53, p21, 망막모세포종 단백질(retinoblastoma, 줄여서 Rb)이 있습니다. 이러한 각 단백질의 조절 역할은 통제되지 않은 복제 세포(즉 암세포)에서 잘못된 복제품이 발견된 후에 발견되었습니다. 이 단백질은 세포주기 초기에 G₁ 확인지점에서 대부분의 조절 효과를 발휘합니다.

p53은 세포가 분할을 하려는 의지에 강한 영향을 미칩니다. p53은 DNA 손상에 반응해 세포 주기를 중단하고 손상을 복구하기 위해 효소를 소환합니다. 만약 DNA 손상이 회복할 수 없다면, p53은 세포자연사(apoptosis)를 유도해 세포가 세포주기를 진행하는 것을 막을 수 있습니다.

p53의 증가는 p21의 생성을 촉발합니다. p21은 CDK/사이클린 복합체(CDK/cyclin complex)에 결합해 세포가 G₁에서 S 기로 진행하는 것을 방지하고, CDK/사이클린 복합체의 양성 조절 작용을 억제합니다.

Rb는 주로 세포 크기에 반응하여 다른 양성 조절자에 작용해 세포 주기를 음성적으로 조절합니다. 활성(탈인산화된; dephosphorylated) Rb는 전사 인자(transcription factor)에 결합해 유전자 전사가 시작되는 것을 방지하고 따라서 단백질 생성을 방지합니다.

Rb가 전사 인자 E2F에 결합하면 Rb는 G₁에서 S 기로 진행하는 데 필요한 단백질의 합성을 억제합니다. 세포가 커짐에 따라, Rb는 활성화되지 않고 E2F에서 분리될 때까지 점차 인산화됩니다. 그제야 E2F는 다음 세포주기 단계로 진행하는 데 필요한 단백질을 생산하는 유전자를 활성화할 수 있습니다.